Summary
Gentagne ikke-ATG-afhængige translationelle produkter er nye patogene træk ved flere gentage ekspansion-baserede sygdomme. Målet med den beskrevne protokol er at evaluere toksicitet forårsaget af disse peptider ved hjælp af adfærdsmæssige og cellulære analyser i modelsystemet C. elegans.
Abstract
C. elegans er almindeligt anvendt til at modellere aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme forårsaget af gentagne ekspansionsmutationer, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Huntingtons Sygdom. For nylig viste det sig, at gentagne ekspansionsholdige RNA var substratet for en ny type proteinoversættelse kaldet genrelateret ikke-AUG-afhængig (RAN) oversættelse. I modsætning til kanonisk oversættelse kræver RAN-oversættelse ikke en start-codon og forekommer kun, når gentagelser overskrider en tærskellængde. Da der ikke er nogen startfarve til at bestemme læserammen, forekommer RAN-oversættelse i alle læserammer fra både sense- og antisense RNA-skabeloner, der indeholder en gentagelsesudvidelsessekvens. Derfor udvider RAN-oversættelse antallet af mulige sygdomsrelaterede giftige peptider fra en til seks. Hidtil har RAN oversættelse blevet dokumenteret i otte forskellige gentage ekspansion-baserede neurodegenerative og neuromuskulære sygdomme. I hvert tilfælde, dechifrere hvilke RAN produkter er giftige, samt deres mekanismer for toksicitet, er et kritisk skridt i retning af at forstå, hvordan disse peptider bidrager til sygdomspatofysiologi. I dette papir præsenterer vi strategier til at måle toksiciteten af RAN peptider i modelsystemet C. elegans. For det første beskriver vi procedurer til måling af RAN peptid toksicitet på vækst og motilitet af at udvikle C. elegans. For det andet beskriver vi en analyse til måling af postudviklingsmæssige, aldersafhængige virkninger af RAN-peptider på motilitet. Endelig beskriver vi en neurotoksicitetsanalyse til vurdering af virkningerne af RAN-peptider på neuronmorfologi. Disse analyser giver en bred vurdering af RAN peptid toksicitet og kan være nyttige for at udføre store genetiske eller små molekyle skærme til at identificere sygdomsmekanismer eller behandlinger.
Introduction
Den uhensigtsmæssige udvidelse af DNA-gentagelsessekvenser er det genetiske grundlag for flere neurodegenerative sygdomme såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og Huntingtons Sygdom (HS)1. Mens der er etableret cellulære og animalske modeller for disse sygdomme, mekanismer, der ligger til grund for disse betingelser er ikke veldefineret. For eksempel er HS forårsaget af udvidelser af en CAG-gentagelsessekvens i kodningssekvensen for Huntingtinproteinet Htt2. Da CAG koder aminosyren glutamin, resulterer CAG-gentagne ekspansion i indsættelsen af et polyglutamin eller polyQ, sekvens i Htt. Ekspanderet polyQ-proteiner danner længde- og aldersafhængige proteinaggregater, der er forbundet med toksicitet3,4. Overraskende nok tyder to nylige undersøgelser på, at længden af polyQ-sekvensen ikke er den vigtigste drivkraft bag HS-sygdomsdebut, hvilket tyder på, at polyQ-uafhængige faktorer også kan bidrage til sygdommen5,6.
En mulig polyQ-uafhængig mekanisme indebærer en nyopdaget type protein oversættelse kaldet Repeat Associated Non-AUG-afhængige (RAN) oversættelse7. Som navnet antyder, ran oversættelse kun opstår, når en udvidet gentagelse sekvens er til stede og kræver ikke en kanonisk start codon. Derfor forekommer RAN-oversættelse i alle tre læserammer i gentagelsen for at producere tre forskellige polypeptider. Hertil kommer, fordi mange gener også producere en antisense udskrift, der indeholder det modsatte supplement af den udvidede gentage sekvens, RAN oversættelse forekommer også i alle tre læserammer af antisense udskrift. Sammen udvider RAN-oversættelsen antallet af proteiner, der er fremstillet af en udvidet repeat-holdige DNA-sekvens fra et peptid til seks peptider. Til dato, RAN oversættelse er blevet observeret i mindst otte forskellige gentage ekspansion lidelser8. RAN peptider er observeret i postmortem patient prøver og kun i tilfælde, hvor patienten bærer en udvidet gentagelse9,10. Mens disse peptider er klart til stede i patientceller, deres bidrag til sygdomspatofysiologi er uklart.
For bedre at definere den potentielle toksicitet forbundet med RAN peptider, flere grupper har udtrykt hvert peptid i forskellige modelsystemer, såsom gær, fluer, mus, og vævkultur celler11,,12,13,14,15,16. I stedet for at udnytte gentagelsessekvensen for udtryk anvender disse modeller en codon-variation-tilgang, hvor gentagelsessekvensen elimineres, men aminosyresekvensen bevares. Oversættelsesinitiering sker gennem en kanonisk ATG, og peptidet smeltes typisk til et fluorescerende protein ved enten N- eller C-endeinus, hvoraf ingen synes at forstyrre RAN peptidtoksicitet. Derfor overudtrykker hver konstruktion et enkelt RAN-peptid. Modellering af de forskellige RAN-produkter i en flercellet organisme med enkle analyser til måling af RAN peptidtoksicitet er af afgørende betydning for at forstå, hvordan de forskellige RAN-produkter fra hver sygdomsfremkaldende gentagne ekspansion bidrager til cellulær dysfunktion og neurodegeneration.
Ligesom andre modelsystemer giver C. elegans en fleksibel og effektiv eksperimentel platform, der muliggør undersøgelser af nye sygdomsmekanismer, såsom RAN peptidtoksicitet. Orme tilbyder flere unikke eksperimentelle egenskaber, der ikke i øjeblikket er tilgængelige i andre modeller af RAN peptid toksicitet. For det første er C. elegans optisk gennemsigtige fra fødslen til døden. Dette giver mulighed for simpel visualisering af RAN peptid udtryk og lokalisering, samt in vivo analyse af neurodegeneration i levende dyr. For det andet er transgene metoder til generering af RAN peptid udtryksmodeller billige og hurtige. I betragtning af C. eleganskorte tre-dages livscyklus kan stabile transgene linjer, der udtrykker et givet RAN-peptid på en celletypespecifik måde, fremstilles på under en uge. For det tredje kan simple fænotypiske output kombineres med genetiske screeningsmetoder, såsom kemisk mutagenese eller RNAi-screening, for hurtigt at identificere gener, der er afgørende for RAN-peptidtoksicitet. Endelig, den korte levetid af C. elegans (~ 20 dage) giver efterforskere til at bestemme, hvordan aldring, som er den største risikofaktor for de fleste gentage ekspansion sygdomme, påvirker RAN peptid toksicitet. Sammen er denne kombination af eksperimentelle egenskaber uovertruffen i ethvert andet modelsystem og tilbyder en kraftfuld platform for studiet af RAN peptid toksicitet.
Her beskriver vi flere analyser, der udnytter de eksperimentelle fordele ved C. elegans til at måle toksiciteten af RAN peptider og til at identificere genetiske modifikater af denne toksicitet. Den codon-varierede ATG-initierede RAN peptider er mærket med GFP og udtrykt individuelt i enten muskelceller under myo-3 promotor eller i GABAergic motor neuroner under unc-47 promotor. For udtryk i muskelceller er det vigtigt, at giftige RAN peptider er mærket med grønt fluorescerende protein (GFP), eller andre fluorescerende protein (FP) tag, der kan målrettes med en RNAi fodring vektor. Dette skyldes, at giftige RAN peptid udtryk normalt blokerer vækst, rendering sådanne stammer ikke-levedygtige. Brugen af gfp(RNAi) inaktiverer REGEL peptidudtryk på betinget vis og tillader stammevedligeholdelse, genetiske kors osv. For analyser fjernes disse dyr fra gfp(RNAi),som gør det muligt at udtrykke RAN-peptidet og de deraf følgende fænotyper. Ud over den molekylære strategi for design codon-varieret RAN peptid udtryk konstruktioner, beskriver vi analyser til måling af udviklingsmæssige toksicitet (larve motilitet og vækst analyse), post-udviklingsmæssige alder-associeret toksicitet (lammelse assay), og neuron morfologiske defekter (commissure assay).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi metoder, der kan bruges til at assay RAN peptid toksicitet modelleret i musklen eller i neuroner af C. elegans. Mens neurodegenerative proteiner har en aldersdebut fænotype hos menneskelige patienter, kan de også udvise udviklingstoksicitet, når de overudtrykkes i modelsystemer. Overekspression har betydelige fortolkende begrænsninger, men det giver også et stærkt udgangspunkt for genetiske eller farmakologiske skærme med henblik på at identificere gener eller lægemidler, der kan vend…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
Riferimenti
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Genetic Modifiers of Huntington’s Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington’s Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington’s Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
- Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
- Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
- Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
- Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
- Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
- Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
- Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
- Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
- O’Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
- Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetica. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
