C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정
Summary
반복-관련 비-ATG 의존적 번역 제품은 여러 반복 확장 기반 질병의 새로운 병원성 특징이다. 기재된 프로토콜의 목적은 모델 시스템 C. elegans에서행동 및 세포 분석술을 사용하여 이들 펩티드에 의한 독성을 평가하는 것이다.
Abstract
C. 예쁜꼬마선충은 근위축성 측삭경화증(ALS) 및 헌팅턴병과 같은 반복적인 팽창 돌연변이로 인한 노화 관련 신경퇴행성 질환을 모델링하는 데 일반적으로 사용됩니다. 최근, 반복 팽창-함유 RNA는 반복-관련 비-8월 의존적(RAN) 번역이라고 불리는 단백질 번역의 새로운 유형에 대한 기질로 나타났다. 표준 번역과 달리 RAN 번역은 시작 코돈이 필요하지 않으며 반복이 임계값 길이를 초과하는 경우에만 발생합니다. 판독 프레임을 결정하는 시작 코돈이 없기 때문에, RAN 번역은 반복 확장 서열을 포함하는 센스 및 안티센스 RNA 템플릿 모두에서 모든 판독 프레임에서 발생한다. 따라서 RAN 번역은 가능한 질병 관련 독성 펩티드의 수를 1개에서 6개로 확장합니다. 지금까지, RAN 번역은 8개의 상이한 확장 기반 신경퇴행성 및 신경근육 질환에서 문서화되었다. 각각의 경우에, RAN 제품이 유독한, 뿐만 아니라 독성의 그들의 기계장치, 이 펩티드가 질병 병리생리학에 어떻게 기여하는지 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 이 백서에서는 모델 시스템 C. elegans에서RAN 펩타이드의 독성을 측정하는 전략을 제시합니다. 첫째, 우리는 C. elegans개발의 성장 그리고 운동성에 RAN 펩티드 독성을 측정하기위한 절차를 설명합니다. 둘째, 우리는 운동성에 RAN 펩티드의 후 개발, 연령 의존적 효과를 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 우리는 신경 형태에 RAN 펩티드의 효력을 평가하기 위한 신경 독성 분석학을 기술합니다. 이 시험은 RAN 펩티드 독성의 광범위한 평가를 제공하고 질병 기계장치 또는 치료를 확인하기 위하여 대규모 유전 또는 작은 분자 스크린을 능력을 발휘하기 위하여 유용할 지도 모릅니다.
Introduction
DNA 반복 서열의 부적절한 확장은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD), 헌팅턴병(HD)1과같은 여러 신경 퇴행성 질환에 대한 유전적 기초이다. 이 질병을 위한 설치한 세포와 동물 모형이 있는 동안, 이 조건의 밑에 기계장치는 잘 정의되지 않습니다. 예를 들어, 헌팅틴 단백질Htt2에대한 코딩 서열에서 CAG 반복 서열의 확장에 의해 헌팅턴파가 발생한다. CAG는 아미노산 글루타민을 인코딩하기 때문에, CAG 반복 팽창은 Htt. 확장폴리Q 단백질 형성 길이 및 연령에 따른 단백질 응집체를 형성하여 폴리글루타민 또는 폴리Q의 삽입을 초래한다3,,4. 놀랍게도, 2개의 최근 연구는 polyQ 서열의 길이가 헌팅턴병 발병의 주요 동인이 아니라는 것을 시사하며, 폴리Q 독립적 인 요인이 또한 질병5,,6에기여할 수 있음을 시사한다.
한 가지 가능한 polyQ 독립적 인 메커니즘은 Repeat A연관 된 N온 – AUG 의존적 (RAN) 번역7이라고불리는 새로 발견된 유형의 단백질 번역을 포함한다. 이름에서 알 수 있듯이 RAN 번역은 확장된 반복 시퀀스가 있고 표준 시작 코돈이 필요하지 않은 경우에만 발생합니다. 따라서 RAN 번역은 3개의 뚜렷한 폴리펩티드를 생성하기 위해 반복의 세 개의 판독 프레임 에서 모두 발생한다. 또한, 많은 유전자가 또한 확장된 반복 서열의 역보체를 포함하는 안티센스 전사체를 생성하기 때문에, RAN 번역은 또한 안티센스 전사체의 세 개의 판독 프레임 에서 발생한다. 함께, RAN 번역은 1개의 펩티드에서 6개의 펩티드에 확장된 반복 함유 DNA 서열에서 생성된 단백질의 수를 확장합니다. 현재까지, RAN 번역은 적어도 8개의 상이한 반복 확장장애8에서관찰되었다. RAN 펩티드는 사후 환자 샘플에서 관찰되며 환자가 확장 된 반복을운반하는 경우에만9,10. 이 펩티드는 참을성 있는 세포에서 명확하게 나타나있는 동안, 질병 병리생리학에 그들의 기여는 불분명합니다.
RAN 펩티드와 관련된 잠재적 독성을 더 잘 정의하기 위해, 여러 그룹은 효모, 파리, 마우스 및 조직 배양 세포11,,12,,13,,14,,15,,16과같은 다양한 모델 시스템에서 각 펩티드를 발현하였다. 발현을 위한 반복 서열을 이용하는 대신, 이 모형은 반복 순서가 제거되고 아미노산 순서가 보존되는 코돈 변이 접근을 채택합니다. 번역 개시는 정식 ATG를 통해 발생하고 펩티드는 전형적으로 N- 또는 C-말단에서 형광 단백질에 융합되며, 둘 중 어느 것도 RAN 펩티드 독성을 방해하는 것으로 나타나지 않습니다. 따라서 각 구문은 단일 RAN 펩티드를 과발현합니다. RAN 펩타이드 독성을 측정하는 간단한 분석을 통해 다세포 유기체에서 상이한 RAN 제품을 모델링하는 것은 각 질병을 유발하는 반복 확장으로부터의 상이한 RAN 생성물이 세포 기능 장애 및 신경 변성에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 매우 중요합니다.
다른 모델 시스템과 마찬가지로 C. elegans는 RAN 펩타이드 독성과 같은 새로운 질병 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 하는 유연하고 효율적인 실험 플랫폼을 제공합니다. 웜은 RAN 펩티드 독성의 다른 모델에서 현재 사용할 수없는 몇 가지 독특한 실험 특성을 제공합니다. 첫째, C. 예쁜꼬마선충은 태어날 때부터 죽음까지 광학적으로 투명합니다. 이것은 살아있는 동물에 있는 신경 변성의 생체 내 분석 뿐만 아니라 RAN 펩티드 발현 및 현지화의 간단한 시각화를 허용합니다. 둘째, RAN 펩티드 발현 모델을 생성하기 위한 형질전환 방법은 저렴하고 빠릅니다. C. elegans의짧은 3 일 수명 주기를 감안할 때, 세포 형 특정 방식으로 임의의 주어진 RAN 펩티드를 발현하는 안정적인 형질전환 라인은 1 주일 이내에 생성 될 수있다. 셋째, 간단한 자형질 출력은 화학적 돌연변이 발생 또는 RNAi 스크리닝과 같은 유전자 스크리닝 방법과 결합되어 RAN 펩타이드 독성에 필수적인 유전자를 신속하게 식별할 수 있습니다. 마지막으로, C. elegans의 짧은 수명 (~20 일)은 대부분의 반복 확장 질병에 대한 가장 큰 위험 인자인 노화가 RAN 펩티드 독성에 미치는 영향을 결정하는 방법을 조사합니다. 함께, 실험 속성의이 조합은 다른 모델 시스템에서 타의 추종을 불허하 고 RAN 펩 티 드 독성의 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공 합니다.
여기에서 우리는 RAN 펩티드의 독성을 측정하고 이 독성의 유전 수정자를 확인하기 위하여 C. elegans의 실험적인 이점을 활용하는 몇몇 측정을 기술합니다. 코돈-다양한 ATG-개시 RAN 펩타이드는 GFP로 태그가 지정되고 myo-3 프로모터 아래의 근육 세포 또는 unc-47 프로모터 하에서 GABAergic 운동 뉴런에서 개별적으로 발현됩니다. 근육 세포에서의 발현을 위해, 독성 RAN 펩타이드는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 RNAi 공급 벡터로 표적화될 수 있는 다른 형광 단백질(FP) 태그로 태그가 지정되는 것이 중요합니다. 이는 독성 RAN 펩타이드 발현이 일반적으로 성장을 차단하기 때문에 이러한 균주를 불가능시로 렌더링합니다. gfp (RNAi)의 사용은 조건부 RAN 펩타이드 발현을 비활성화하고 긴장 유지, 유전 십자가 등을 허용합니다. 검안의 경우, 이들 동물은 gfp(RNAi)에서제거되어 RAN 펩타이드및 생성된 표현형의 발현을 허용한다. 코돈-다양한 RAN 펩타이드 발현 구조를 설계하기 위한 분자 전략 외에도, 우리는 발달 독성(애벌레 운동성 및 성장 분석), 개발 후 연령 관련 독성(마비 분석) 및 신경 형태학적 결함(commissure assay)을 측정하기 위한 분석서를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 근육또는 C. elegans의신경에서 모델링된 RAN 펩티드 독성을 분석하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보고합니다. 신경 퇴행성 단백질은 인간 환자에서 나이 개시 표현형을 가지고 있는 동안, 그(것)들은 또한 모형 시스템에서 과발현될 때 발달 독성을 전시할 수 있습니다. 과발현은 유의한 해석적 한계를 가지고 있지만, 독성 표현형을 역전시킬 수 있는 유전자 또는 약물을 식…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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