Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

Paige Rudich; Carley Snoznik; Noah Puleo; Todd Lamitina

doi:10.3791/61024

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Articolo metodologico

Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

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DOI:

10.3791/61024

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30 aprile 2020

Paige Rudich¹ , Carley Snoznik² , Noah Puleo² , Todd Lamitina¹^,²

¹Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, ²Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

In questo articolo

Sommario

I prodotti traslazionali non dipendenti dall'ATG sono caratteristiche patogene emergenti di diverse malattie basate sull'espansione delle ripetizioni. L'obiettivo del protocollo descritto è quello di valutare la tossicità causata da questi peptidi utilizzando saggi comportamentali e cellulari nel sistema modello C. elegans.

Abstract

C. elegans è comunemente usato per modellare malattie neurodegenerative legate all'età causate da mutazioni di espansione ripetute, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia di Huntington. Recentemente, l'RNA che lo contiene espansione ripetuta è il substrato per un nuovo tipo di traduzione di proteine chiamato traduzione non dipendente da AUG (RAN) associata alla ripetizione. A differenza della traduzione canonica, la conversione RAN non richiede un codone iniziale e si verifica solo quando le ripetizioni superano una lunghezza di soglia. Poiché non esiste un codone iniziale per determinare il fotogramma di lettura, la traduzione RAN si verifica in tutti i fotogrammi di lettura da modelli di RNA di senso e antisenso che contengono una sequenza di espansione di ripetizione. Pertanto, la traduzione RAN espande il numero di possibili peptidi tossici associati alla malattia da uno a sei. Finora, la traduzione RAN è stata documentata in otto diverse malattie neurodegenerative e neuromuscolari basate sull'espansione delle ripetizioni. In ogni caso, decifrare quali prodotti RAN sono tossici, così come i loro meccanismi di tossicità, è un passo fondamentale per capire come questi peptidi contribuiscono alla fisiopatologia della malattia. In questo articolo, presentiamo strategie per misurare la tossicità dei peptidi RAN nel sistema modello C. elegans. In primo luogo, descriviamo le procedure per misurare la tossicità dei peptidi RAN sulla crescita e la motilità dello sviluppo di C. elegans. In secondo luogo, abbiamo dettagliato un saggio per misurare gli effetti post-sviluppo dipendenti dall'età dei peptidi RAN sulla motilità. Infine, descriviamo un saggio di neurotossicità per valutare gli effetti dei peptidi RAN sulla morfologia dei neuroni. Questi saggi forniscono un'ampia valutazione della tossicità dei peptidi RAN e possono essere utili per l'esecuzione di schermi genetici o di piccole molecole su larga scala per identificare meccanismi o terapie della malattia.

Introduzione

L'espansione inappropriata delle sequenze di ripetizione del DNA è la base genetica di diverse malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e la malattia di Huntington (HD)¹. Sebbene esistano modelli cellulari e animali consolidati per queste malattie, i meccanismi alla base di queste condizioni non sono ben definiti. Ad esempio, l'HD è causato dalle espansioni di una sequenza di ripetizione CAG nella sequenza di codifica per la proteina Huntingtina Htt². Poiché CAG codifica la glutammina degli amminoacidi, l'espansione della ripetizione CAG comporta l'inserimen....