Summary
Gjentatte tilknyttede ikke-ATG-avhengige translasjonelle produkter er nye patogene trekk ved flere gjentatte ekspansjonsbaserte sykdommer. Målet med den beskrevne protokollen er å evaluere toksisitet forårsaket av disse peptidene ved hjelp av atferds- og cellulære analyser i modellsystemet C. elegans.
Abstract
C. elegans brukes ofte til å modellere aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer forårsaket av gjentatte ekspansjonsmutasjoner, som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Huntingtons sykdom. Nylig ble gjentatt ekspansjonsholdig RNA vist seg å være substratet for en ny type proteinoversettelse kalt gjentatt assosiert ikke-AUG-avhengig (RAN) oversettelse. I motsetning til kanonisk oversettelse krever IKKE RAN-oversettelse en start-kodon, og oppstår bare når gjentakelser overskrider en terskellengde. Fordi det ikke er noen start codon å bestemme leserammen, OPPSTÅR RAN oversettelse i alle leserammer fra både sense og antisense RNA-maler som inneholder en gjentatt utvidelsessekvens. Ran-oversettelse utvider derfor antall mulige sykdomsrelaterte toksiske peptider fra én til seks. Så langt har RAN oversettelse blitt dokumentert i åtte forskjellige gjenta ekspansjonsbaserte nevrodegenerative og nevromuskulære sykdommer. I hvert tilfelle er dechiffrering som RAN-produkter er giftige, så vel som deres toksisitetsmekanismer, et kritisk skritt mot å forstå hvordan disse peptidene bidrar til sykdomspatiologi. I denne artikkelen presenterer vi strategier for å måle toksisiteten av RAN peptider i modellsystemet C. elegans. Først beskriver vi prosedyrer for måling av RAN peptidtoksisitet på vekst og motilitet av å utvikle C. elegans. For det andre beskriver vi en analyse for måling av postutvikling, aldersavhengige effekter av RAN-peptider på motilitet. Til slutt beskriver vi en nevrotoksisitetsanalyse for evaluering av effekten av RAN peptider på nevronmorfologi. Disse analysene gir en bred vurdering av RAN peptid toksisitet og kan være nyttig for å utføre store genetiske eller små molekylskjermer for å identifisere sykdomsmekanismer eller terapier.
Introduction
Den upassende utvidelsen av DNA-gjentatte sekvenser er det genetiske grunnlaget for flere nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og Huntingtons sykdom (HD)1. Mens det er etablerte cellulære og dyremodeller for disse sykdommene, er mekanismer som ligger til grunn for disse forholdene ikke godt definert. For eksempel er HD forårsaket av utvidelser av en CAG-gjentakelsessekvens i kodesekvensen for Huntingtin-proteinet Htt2. Fordi CAG koder aminosyreglutamin, resulterer CAG-repetisjonsutvidelsen i innsetting av en polyglutamin, eller polyQ, sekvens i Htt. Utvidede polyQ-proteiner danner lengde- og aldersavhengige proteinaggregater som er forbundet med toksisitet3,4. Overraskende, to nyere studier tyder på at lengden på polyQ sekvensen er ikke den viktigste driveren for HS sykdom utbruddet, noe som tyder på at polyQ-uavhengige faktorer kan også bidra til sykdommen5,6.
En mulig polyQ-uavhengig mekanisme innebærer en nylig oppdaget type protein oversettelse kalt Repeat Enssociated Non-AUG-avhengig (RAN) oversettelse7. Som navnet tilsier, skjer RAN-oversettelse bare når en utvidet gjentakelsessekvens er til stede og krever ikke en kanonisk startcodon. Derfor skjer RAN-oversettelse i alle tre leserammer av repetisjonen for å produsere tre forskjellige polypeptider. I tillegg, fordi mange gener også produserer en antisense transkripsjon som inneholder omvendt komplement av den utvidede gjentakelsessekvensen, oppstår RAN-oversettelse også i alle tre leserammer av antisensetranskripsjonen. Sammen utvider RAN-oversettelse antall proteiner produsert fra en utvidet gjentatt DNA-sekvens fra ett peptid til seks peptider. Hittil har RAN oversettelse blitt observert i minst åtte forskjellige gjentatte ekspansjonsforstyrrelser8. RAN peptider observeres i postmortem pasientprøver og bare i tilfeller der pasienten bærer en utvidet gjentakelse9,10. Mens disse peptidene er tydelig tilstede i pasientceller, er deres bidrag til sykdomspatofiologi uklart.
For bedre å definere den potensielle toksisiteten forbundet med RAN peptider, har flere grupper uttrykt hvert peptid i ulike modellsystemer, for eksempel gjær, fluer, mus og vevskulturceller11,,12,13,14,15,16. I stedet for å bruke gjentakelsessekvensen for uttrykk, bruker disse modellene en codon-variasjonstilnærming der gjentakelsessekvensen elimineres, men aminosyresekvensen bevares. Oversettelsesinitiering skjer gjennom en kanonisk ATG, og peptidet er vanligvis smeltet sammen til et fluorescerende protein ved enten N- eller C-terminus, og ingen av dem ser ut til å forstyrre RAN peptidtoksisitet. Derfor overuttrykker hver konstruksjon et enkelt RAN-peptid. Modellering av de forskjellige RAN-produktene i en flercellet organisme med enkle analyser for å måle RAN peptidtoksisitet er viktig å forstå hvordan de forskjellige RAN-produktene fra hver sykdomsfremkallende gjentatt ekspansjon bidrar til cellulær dysfunksjon og nevrodegenerasjon.
Som andre modellsystemer gir C. elegans en fleksibel og effektiv eksperimentell plattform som muliggjør studier av nye sykdomsmekanismer, for eksempel RAN peptidtoksisitet. Ormer tilbyr flere unike eksperimentelle attributter som for øyeblikket ikke er tilgjengelige i andre modeller av RAN peptidtoksisitet. For det første er C. elegans optisk gjennomsiktig fra fødsel til død. Dette gjør det mulig for enkel visualisering av RAN peptid uttrykk og lokalisering, samt in vivo analyse av neurodegeneration i levende dyr. For det andre er transgene metoder for å generere RAN peptiduttrykksmodeller billig og rask. Gitt den korte tre-dagers livssyklusen til C. elegans,stabile transgene linjer som uttrykker en gitt RAN peptid på en celle-type spesifikk måte kan produseres på under en uke. For det tredje kan enkle fenotypic utganger kombineres med genetiske screeningmetoder, som kjemisk mutagenesis eller RNAi screening, for raskt å identifisere gener som er avgjørende for RAN peptidtoksisitet. Til slutt, den korte levetiden til C. elegans (~ 20 dager) tillater etterforskere å bestemme hvordan aldring, som er den største risikofaktoren for de fleste gjentatte ekspansjonssykdommer, påvirker RAN peptid toksisitet. Sammen er denne kombinasjonen av eksperimentelle attributter uovertruffen i et annet modellsystem og tilbyr en kraftig plattform for studiet av RAN peptidtoksisitet.
Her beskriver vi flere analyser som utnytter de eksperimentelle fordelene med C. elegans for å måle toksisiteten til RAN-peptider og for å identifisere genetiske modifikatorer av denne toksisiteten. De codon-varierte ATG-initierte RAN peptider er merket med GFP og uttrykkes individuelt i enten muskelceller under myo-3 arrangør eller i GABAergic motor nevroner under unc-47 arrangør. For uttrykk i muskelceller er det viktig at giftige RAN peptider er merket med grønt fluorescerende protein (GFP), eller andre fluorescerende protein (FP) tag som kan målrettes med en RNAi fôring vektor. Dette er fordi giftig RAN peptid uttrykk vanligvis blokkerer vekst, noe som gjør slike stammer ikke levedyktig. Bruken av gfp(RNAi) betinget inaktiverer RAN peptid uttrykk og tillater belastning vedlikehold, genetiske kors, etc. For analyser fjernes disse dyrene fra gfp(RNAi),som tillater uttrykk for RAN-peptidet og de resulterende fenotypene. I tillegg til den molekylære strategien for å designe codon-varierte RAN peptiduttrykkskonstruksjoner, beskriver vi analyser for måling av utviklingstoksisitet (larvemotilitet og vekstanalyse), postutviklingsalderassosiert toksisitet (lammelsesanalyse) og nevronmorfologiske defekter (commissure analyse).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi metoder som kan brukes til å analyse RAN peptid toksisitet modellert i muskelen eller i nevronene i C. elegans. Mens nevrodegenerative proteiner har en aldersinnsettende fenotype hos menneskelige pasienter, kan de også vise utviklingsmessig toksisitet når de er overuttrykt i modellsystemer. Overexpression har betydelige tolkende begrensninger, men det gir også et kraftig utgangspunkt for genetiske eller farmakologiske skjermer som tar sikte på å identifisere gener eller legemidler som ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
References
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Genetic Modifiers of Huntington’s Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington’s Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington’s Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
- Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
- Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
- Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
- Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
- Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
- Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
- Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
- Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
- O’Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
- Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
