Fluorescerende immunolocalisering af Arabinogalactan proteiner og pektiner i cellevæggen af plantevæv

Summary

Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan plantematerialet til immunolocalisering af Arabinogalactan proteiner og pektiner er fastgjort, indlejret i en hydrofil akrylharpiks, sektionsopdelt og monteret på glasrutsjebaner. Vi viser cellevæg relaterede epitoper vil blive opdaget med specifikke antistoffer.

Abstract

Planteudvikling indebærer konstante justeringer af cellevæggens sammensætning og struktur som reaktion på både interne og eksterne stimuli. Cellevægge består af cellulose og ikke-celluloseiske polysaccharider sammen med proteiner, phenolforbindelser og vand. 90% af cellevæggen består af polysaccharider (f.eks. pectiner) og arabinogalactanproteiner (AGP). Den fluorescerende immunolocalisering af specifikke glycan epitoper i plante histologiske sektioner forbliver et vigtigt redskab til at afdække remodeling af vægpolysaccharidnetværk, struktur og komponenter.

Her rapporterer vi en optimeret fluorescerende immunolocaliseringsprocedure til påvisning af glycan epitoper fra AGP’er og pektiner i plantevæv. Paraformaldehyd/glutaraldehydfiksering blev anvendt sammen med LR-White indlejring af planteprøverne, hvilket giver mulighed for en bedre bevarelse af vævsstrukturen og sammensætningen. Tynde dele af de indlejrede prøver opnået med en ultramikromit blev brugt til immunolocalisering med specifikke antistoffer. Denne teknik giver stor opløsning, høj specificitet, og chancen for at opdage flere glycan epitoper i samme prøve. Denne teknik tillader subcellulær lokalisering af glycaner og registrerer deres akkumuleringsniveau i cellevæggen. Det giver også mulighed for at bestemme spatio-tidsmæssige mønstre af AGP og pectin distribution under udviklingsprocesser. Brugen af dette værktøj kan i sidste ende guide forskningsretninger og forbinde glycaner med specifikke funktioner i planter. Desuden kan de indhentede oplysninger supplere biokemiske undersøgelser og genekspressionsundersøgelser.

Introduction

Plantecellevægge er komplekse strukturer bestående af polysaccharider og glycoproteiner. Cellevægge er ekstremt dynamiske strukturer, hvis arkitektur, organisation og sammensætning varierer afhængigt af celletype, lokalisering, udviklingsstadium, eksterne og interne stimuli¹. Arabinogalactan proteiner (AGP) og pektiner er vigtige komponenter i plantecellevæggen. AGP’er er meget glykosylerede proteiner, og pektiner er homogalacturonan polysaccharider, hvis sammensætning, mængde og struktur varierer meget i forskellige planteudviklingsstadier^2,3,4. AGP’er og pektinundersøgelser har afsløret deres involvering i flere planteprocesser såsom programmeret celledød, reaktion på abiotiske belastninger, seksuel plantegengivelse, blandt mange andre⁵. De fleste af disse undersøgelser startede med oplysninger fra immunolocaliseringsundersøgelser.

I betragtning af dens kompleksitet kræver studiet af cellevægge mange forskellige værktøjer. Påvisning af glycan epitoper ved hjælp af monoklonale antistoffer (mAbs) er en værdifuld tilgang til at løse polysaccharid og glycoprotein distribution langs denne struktur. Der er en stor samling af mAb’er til rådighed til påvisning af glycan epitoper, og specificiteten af hver mAb forbedres løbende samt⁶. Teknikken her beskrevet gælder for alle plantearter, og er et perfekt værktøj til at guide fremtidige forskningsretninger, der kan involvere dyrere og komplekse teknikker.

I denne teknik er specifikke antistoffer kemisk konjugeret til fluorescerende farvestoffer som FITC (fluorescein isothiocyanat), TRITC (tetramethylrhodamin-5-(og 6)-isothiocyanat) eller flere Alexa Fluor farvestoffer. Immunofluorescens giver flere fordele, så en klar og hurtig subcellulær lokalisering af glycaner, der kan observeres direkte under et fluorescensmikroskop. Det er meget specifikt og følsomt, da forberedelsen af prøven effektivt kan beskytte antigenets naturlige struktur, selvom det er til stede i lavere mængder. Det gør det muligt at detektere flere antigener i samme prøve og vigtigst af alt, tilbyder høj kvalitet og visuelt smukke resultater. På trods af den store magt, der tilbydes af fluorescens immunolocalization undersøgelser, er de ofte betragtes som vanskelige at udføre og gennemføre sandsynligvis på grund af manglen på detaljerede protokoller gør det muligt at visualisering af de forskellige trin i proceduren. Her giver vi nogle enkle retningslinjer for, hvordan man udfører denne teknik, og hvordan man får billeder i høj kvalitet.

For den protokol, der præsenteres her, skal prøver først fastgøres og integreres ved hjælp af det mest passende fikseringsmiddel. Selvom det betragtes som en tidskrævende og relativt kedelig teknik, er korrekt fiksering og indlejring af planteprøven nøglen til at sikre en vellykket immunolocaliseringsanalyse. Til dette formål er den mest almindelige kemisk fiksering ved hjælp af crosslinking fikseringsmidler, som aldehyder. Krydssammenhængende fikseringsmidler etablerer kemiske bindinger mellem molekyler af vævet, stabiliserer og hærder prøven. Formaldehyd og glutaraldehyd er krydssammenhængende fikseringsmidler, og nogle gange anvendes en blanding af begge fikseringsmidler⁷. Formaldehyd giver stor strukturel bevarelse af væv og i længere tid, producerer små væv tilbagetrækninger og er forenelig med immunostaining. Glutaraldehyd er et stærkere og stabilt fikseringsmiddel, der normalt anvendes i kombination med formaldehyd. Brugen af glutaraldehyd har nogle ulemper, der skal tages i betragtning, da det introducerer nogle frie aldehydgrupper i det faste væv, hvilket kan generere en vis uspecifik mærkning. Også krydsfeltet mellem proteiner og andre molekyler lejlighedsvis kan gøre nogle mål epitoper utilgængelige for antistoffer. For at undgå dette skal fastgørelsens mængde og varighed defineres omhyggeligt.

Efter fiksering er prøver indlejret i den rigtige harpiks for at hærde, før de får sektionerne. London Harpiks (LR-White) akryl harpiks er harpiks valg for immunolocalization undersøgelser. I modsætning til andre harpikser er LR-White hydrofil, hvilket gør det muligt for antistofferne at nå deres antigener uden behov for nogen behandling for at lette det. LR-White har også den fordel, at tilbyde lav auto-fluorescens, så en reduktion i baggrundsstøj under immunfluorescens imaging.

Der er mange farvning teknikker til rådighed til at opdage forskellige komponenter i cellevæggen, såsom Alcian blå farvning, toluidin blå farvning eller Periodisk syre-Schiff (PAS) farvning. Ingen af disse giver kraften i immunolocaliseringsanalyser⁸. Denne tilgang giver større specificitet i påvisning af glykaner, der tilbyder langt mere information om cellevæg sammensætning og struktur.

Protocol

1. Prøveforberedelse: fiksering, dehydrering og LR-Hvid indlejring Fiksering og dehydreringBEMÆRK: Fikseringsprocessen er afgørende for at bevare prøven. ved at krydslinke molekyler stoppes cellemetabolismen, hvilket sikrer cellulær integritet og forhindrer molekylær diffusion. Fikseringsmidlerne og den anvendte koncentration skal tilpasses dette formål, således at antigenet er tilstrækkeligt udsat for at interagere med antistofferne. Følgende protokol kombinerer den milde fikseri…

Representative Results

I et vellykket eksperiment vil det sekundære antistof specifikt lokalisere placeringen af den specifikke epitop i lysegrøn, på en ensartet måde, hvilket giver mulighed for karakterisering af cellevægsammensætningen i et bestemt udviklingsstadium i cellen, vævet eller organet. For eksempel LM6 antistof har en høj affinitet for 1,5-arabinan, en forbindelse med type-I rhamnogalacturonan, der kan findes rigeligt mærkning cellevæggen af den udviklende Quercus suber anther (Figur 2A</str…

Discussion

Den fluorescerende immunolocalization metode i planter her beskrevet, mens problemfrit ligetil, er afhængig af succesen med flere små trin. Den første er prøveforberedelse og fiksering. I løbet af dette første trin anvendes en blanding af formaldehyd og glutaraldehyd til at krydse størstedelen af cellekomponenterne. Formaldehyd i opløsningen giver en mild og reversibel fiksering, mens glutaraldehyd giver en stærk mere permanent sammenkobling; balancen mellem de to fikseringsmidler giver en passende mængde kryds…

Materials

25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)