Immunolocalisation fluorescente des protéines arabinogalactan et des pectines dans la paroi cellulaire des tissus végétaux
Summary
Ce protocole décrit en détail comment le matériel végétal pour l’immunolocalisation des protéines arabinogalactan et des pectines est fixé, incorporé dans une résine acrylique hydrophilique, sectionné et monté sur des glissières en verre. Nous montrons que des épitopes liés à la paroi cellulaire seront détectés avec des anticorps spécifiques.
Abstract
Le développement des plantes implique des ajustements constants de la composition et de la structure de la paroi cellulaire en réponse à des stimuli internes et externes. Les parois cellulaires sont composées de cellulose et de polysaccharides non cellulosiques ainsi que de protéines, de composés phénoliques et d’eau. 90 % de la paroi cellulaire est composée de polysaccharides (p. ex., pectines) et de protéines arabinogalactan (APC). L’immunolocalisation fluorescente d’épitopes glycan spécifiques dans les sections histologiques végétales demeure un outil clé pour découvrir le remodelage des réseaux, de la structure et des composants de polysaccharide de mur.
Ici, nous rapportons une procédure optimisée d’immunolocalisation fluorescente pour détecter les épitopes glycan des ARG et des pectines dans les tissus végétaux. La fixation de paraformaldéhyde/glutaraldehyde a été employée avec l’intégration LR-White des échantillons de plante, permettant une meilleure conservation de la structure et de la composition de tissu. Des sections minces des échantillons incorporés obtenus avec un ultra-microtome ont été utilisées pour l’immunolocalisation avec des anticorps spécifiques. Cette technique offre une grande résolution, une grande spécificité et la possibilité de détecter plusieurs épitopes glycan dans le même échantillon. Cette technique permet la localisation subcellulaire des glycanes et détecte leur niveau d’accumulation dans la paroi cellulaire. Il permet également la détermination des modèles spatio-temporels de la distribution d’AGP et de pectine pendant des processus développementaux. L’utilisation de cet outil peut en fin de compte guider les orientations de recherche et relier les glycanes à des fonctions spécifiques chez les plantes. En outre, les informations obtenues peuvent compléter les études biochimiques et d’expression génique.
Introduction
Les parois cellulaires végétales sont des structures complexes composées de polysaccharides et de glycoprotéines. Les parois cellulaires sont des structures extrêmement dynamiques dont l’architecture, l’organisation et la composition varient selon le type de cellule, la localisation, le stade de développement, les stimuli externeset internes 1. Les protéines arabinogalactan (AGPs) et les pectines sont des composants importants de la paroi cellulaire végétale. Les APC sont des protéines fortement glycoylées et les pectines sont des polysaccharides homogalacturonan dont la composition, la quantité et la structure varient considérablement au cours des différents stades de développementvégétal 2,3,4. Les AIG et les études sur la pectine ont révélé leur implication dans plusieurs processus végétaux tels que la mort cellulaire programmée, la réponse aux stress abiotiques, la reproduction sexuelle des plantes, parmi beaucoupd’autres 5. La plupart de ces études ont commencé avec des informations obtenues à partir d’études d’immunolocalisation.
Compte tenu de sa complexité, l’étude des parois cellulaires nécessite de nombreux outils différents. La détection des épitopes glycan à l’aide d’anticorps monoclonaux (mAbs) est une approche précieuse pour résoudre la distribution du polysaccharide et de la glycoprotéine le long de cette structure. Il existe une grande collection de mAbs disponibles pour détecter les épitopes glycan et la spécificité de chaque mAb est continuellement améliorée ainsi6. La technique décrite ici s’applique à toutes les espèces végétales, et est un outil parfait pour guider les orientations futures de recherche qui pourraient impliquer des techniques plus coûteuses et complexes.
Dans cette technique, des anticorps spécifiques sont chimiquement conjugués à des colorants fluorescents tels que fitc (fluorescéine isothiocyanate), TRITC (tétramethylrhodamine-5-(et 6)-isothiocyanate) ou plusieurs colorants Alexa Fluor. L’immunofluorescence offre plusieurs avantages, permettant une localisation subcellulaire claire et rapide des glycans qui peut être directement observée au microscope à fluorescence. Il est très spécifique et sensible, puisque la préparation de l’échantillon peut effectivement protéger la structure naturelle de l’antigène, même s’il est présent en plus faibles quantités. Il permet la détection de plusieurs antigènes dans le même échantillon et le plus important, offre des résultats de haute qualité et visuellement belle. Malgré la grande puissance offerte par les études d’immunolocalisation de fluorescence, elles sont souvent considérées comme difficiles à exécuter et à mettre en œuvre très probablement en raison de l’absence de protocoles détaillés permettant la visualisation des différentes étapes de la procédure. Ici, nous fournissons quelques lignes directrices simples sur la façon d’effectuer cette technique et comment obtenir des images de haute qualité.
Pour le protocole présenté ici, les échantillons doivent d’abord être corrigés et intégrés à l’aide du fixatif le plus approprié. Bien que considérée comme une technique longue et relativement fastidieuse, la fixation et l’intégration appropriées de l’échantillon végétal sont la clé pour assurer un essai d’immunolocalisation réussi. À cette fin, le plus habituel est la fixation chimique à l’aide de fixatifs de liaison croisée, comme les aldéhydes. Les fixatifs croisés établissent des liaisons chimiques entre les molécules du tissu, stabilisant et durcissant l’échantillon. Le formaldéhyde et le glutaraldehyde sont des fixatifs de liaison croisée, et parfois un mélange des deux fixatifs est employé7. Le formaldéhyde offre une grande préservation structurelle des tissus et pendant de longues périodes de temps, produisant de petites rétractations tissulaires et étant compatible avec l’immunostaining. Le glutaraldehyde est un fixatif plus fort et stable habituellement utilisé en combinaison avec le formaldéhyde. L’utilisation du glutaraldehyde présente certains inconvénients qui doivent être pris en compte car il introduit certains groupes d’aldéhyde libre dans le tissu fixe, ce qui peut générer une certaine étiquetage non spécifique. En outre, le croisement entre les protéines et d’autres molécules peut parfois rendre certaines épitopes cibles inaccessibles pour les anticorps. Pour éviter cela, la quantité et la durée de la fixation doivent être soigneusement définies.
Après fixation, les échantillons sont incorporés dans la résine appropriée pour durcir avant d’obtenir les sections. La résine acrylique London Resin (LR-White) est la résine de choix pour les études d’immunolocalisation. Contrairement à d’autres résines, LR-White est hydrophile, permettant aux anticorps d’atteindre leurs antigènes, sans aucun traitement pour le faciliter. LR-White a également l’avantage d’offrir une faible fluorescence automatique, permettant une réduction du bruit de fond pendant l’imagerie par immunofluorescence.
Il existe de nombreuses techniques de coloration disponibles pour détecter différents composants de la paroi cellulaire, tels que la coloration bleue alcienne, la coloration bleue toluidine ou la coloration périodique de l’acide schiff (PAS). Aucun d’entre eux n’offre le pouvoir des analyses d’immunolocalisation8. Cette approche donne une plus grande spécificité dans la détection des glycanes, offrant des informations plus vastes concernant la composition et la structure des parois cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode d’immunolocalisation fluorescente chez les plantes décrite ici, bien que parfaitement simple, repose sur le succès de plusieurs petits pas. Le premier est la préparation et la fixation de l’échantillon. Au cours de cette première étape, un mélange de formaldéhyde et de glutaraldehyde est utilisé pour croiser la majorité des composants cellulaires. Le formaldéhyde dans la solution fournit une fixation douce et réversible tandis que le glutaraldehyde fournit un lien plus fort et plus permanent ;…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs ont reçu le soutien du projet de l’UE 690946 « SexSeed » (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) financé par H2020-MSCA-RISE-2015 et SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. Amp a reçu une subvention du projet MSCA-IF-2016 de l’Union européenne (n° 753328). MC a reçu une subvention de la FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
Riferimenti
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