Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l’immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Abstract

Lo sviluppo dell’impianto comporta regolazioni costanti della composizione e della struttura della parete cellulare in risposta a stimoli sia interni che esterni. Le pareti cellulari sono composte da cellulosa e polisaccaridi non cellulosici insieme a proteine, composti fenolici e acqua. Il 90% della parete cellulare è composto da polisaccaridi (ad esempio, pectine) e proteine arabinogalactane (ARP). L’immunolocalizzazione fluorescente di specifici epitopi glicani nelle sezioni istologiche vegetali rimane uno strumento chiave per scoprire il rimodellamento delle reti, della struttura e dei componenti del polisaccaride delle pareti.

Qui, segnalamo una procedura di immunolocalizzazione fluorescente ottimizzata per rilevare epitopi glicani da ARP e pectine nei tessuti vegetali. La fissazione della paraformaldeide/glutaraldeide è stata utilizzata insieme all’incorporamento LR-White dei campioni vegetali, consentendo una migliore conservazione della struttura e della composizione dei tessuti. Sezioni sottili dei campioni incorporati ottenuti con un ultra-microtomo sono state utilizzate per l’immunolocalizzazione con anticorpi specifici. Questa tecnica offre grande risoluzione, alta specificità e la possibilità di rilevare più epitopi glicani nello stesso campione. Questa tecnica consente la localizzazione subcellulare dei glicani e rileva il loro livello di accumulo nella parete cellulare. Consente inoltre la determinazione dei modelli spazio-temporali di distribuzione dell’AGP e della pectina durante i processi di sviluppo. L’uso di questo strumento può in ultima analisi guidare le direzioni di ricerca e collegare i glicani a funzioni specifiche nelle piante. Inoltre, le informazioni ottenute possono integrare gli studi biochimici e di espressione genica.

Introduction

Le pareti delle cellule vegetali sono strutture complesse composte da polisaccaridi e glicoproteine. Le pareti cellulari sono strutture estremamente dinamiche la cui architettura, organizzazione e composizione variano a seconda del tipo di cella, della localizzazione, dello stadio di sviluppo, degli stimoli esterni e interni^1. Le proteine arabinogalactane (ARP) e le pectine sono componenti importanti della parete cellulare della pianta. Gli ARP sono proteine altamente glicosilate e le pectine sono polisaccaridi omogalattivonan la cui composizione, quantità e struttura variano notevolmente durante le diverse fasi di sviluppo delle^{piante 2,3,4}. ARP e studi sulla pectina hanno rivelato il loro coinvolgimento in diversi processi vegetali come la morte cellulare programmata, la risposta a stress abiotici, la riproduzione delle piante sessuali, tra molti^{altri 5}. La maggior parte di questi studi è iniziata con informazioni ottenute da studi di immunolocalizzazione.

Data la sua complessità, lo studio delle pareti cellulari richiede molti strumenti diversi. Il rilevamento di epitopi glicani utilizzando anticorpi monoclonali (mAbs) è un approccio prezioso per risolvere la distribuzione di polisaccaride e glicoproteina lungo questa struttura. C’è una vasta collezione di mAb disponibili per rilevare epitopi glicani e la specificità di ogni mAb viene continuamente migliorata^{anche 6}. La tecnica qui descritta è applicabile a tutte le specie vegetali ed è uno strumento perfetto per guidare le direzioni di ricerca future che potrebbero comportare tecniche più costose e complesse.

In questa tecnica, anticorpi specifici sono coniugati chimicamente a coloranti fluorescenti come FITC (isotiocianato di fluoresceina), TRITC (tetrametillrhodamina-5-(e 6)-isotiocianato) o diversi coloranti Alexa Fluor. L’immunofluorescenza offre diversi vantaggi, consentendo una localizzazione subcellulare chiara e rapida dei glicani che possono essere osservati direttamente al microscopio a fluorescenza. È altamente specifico e sensibile, poiché la preparazione del campione può proteggere efficacemente la struttura naturale dell’antigene, anche se presente in quantità inferiori. Consente il rilevamento di più antigeni nello stesso campione e, cosa più importante, offre risultati di alta qualità e visivamente belli. Nonostante la grande potenza offerta dagli studi di immunolocalizzazione a fluorescenza, sono spesso considerati difficili da eseguire e implementare molto probabilmente a causa della mancanza di protocolli dettagliati che consentono la visualizzazione delle diverse fasi della procedura. Qui, forniamo alcune semplici linee guida su come eseguire questa tecnica e su come ottenere immagini di alta qualità.

Per il protocollo qui presentato, i campioni devono prima essere corretti e incorporati utilizzando il fissatore più appropriato. Sebbene considerata una tecnica dispendiosa in termini di tempo e relativamente noiosa, una corretta fissazione e incorporamento del campione vegetale è la chiave per garantire un test di immunolocalizzazione di successo. A questo scopo, il più comune è la fissazione chimica usando fissanti reticali, come le aldeidi. I fissatori incrociati stabiliscono legami chimici tra molecole del tessuto, stabilizzando e indurendo il campione. La formaldeide e la glutaraldeide sono fissivi di collegamento incrociato e talvolta viene utilizzata una combinazione di entrambi i fissivi⁷. La formaldeide offre una grande conservazione strutturale dei tessuti e per lunghi periodi di tempo, producendo piccole retrazioni tissutali ed essendo compatibile con l’immunostaining. La glutaraldeide è un fissatore più forte e stabile solitamente usato in combinazione con la formaldeide. L’uso della glutaraldeide ha alcuni svantaggi che devono essere presi in considerazione in quanto introduce alcuni gruppi di aldeide liberi nel tessuto fisso, che possono generare qualche etichettatura aspecifica. Anche il collegamento incrociato tra proteine e altre molecole occasionalmente può rendere alcuni epitopi bersaglio inaccessibili per gli anticorpi. Per evitare ciò, la quantità e la durata della fissazione devono essere accuratamente definite.

Dopo la fissazione, i campioni vengono incorporati nella resina corretta per indurirsi prima di ottenere le sezioni. La resina acrilica London Resin (LR-White) è la resina preferita per gli studi di immunolocalizzazione. A differenza di altre resine, LR-White è idrofilo, permettendo agli anticorpi di raggiungere i loro antigeni, senza bisogno di alcun trattamento per facilitarlo. LR-White ha anche il vantaggio di offrire una bassa autofluorescenza, consentendo una riduzione del rumore di fondo durante l’imaging ad immunofluorescenza.

Ci sono molte tecniche di colorazione disponibili per rilevare diversi componenti della parete cellulare, come la colorazione blu alciana, la colorazione blu toluidina o la colorazione periodica acido-schiff (PAS). Nessuno di questi offre il potere delle analisi di immunolocalizzazione⁸. Questo approccio fornisce una maggiore specificità nel rilevamento dei glicani, offrendo informazioni più vaste sulla composizione e la struttura della parete cellulare.

Protocol

1. Preparazione del campione: fissazione, disidratazione e incorporamento LR-White Fissazione e disidratazioneNOTA: il processo di fissazione è fondamentale per preservare il campione; incrociando le molecole il metabolismo cellulare viene interrotto, garantendo l’integrità cellulare e prevenendo la diffusione molecolare. Gli agenti fissivi e la concentrazione utilizzata devono essere adeguati a tale scopo, lasciando gli antigeni sufficientemente esposti per interagire con gli anticorpi. …

Representative Results

In un esperimento riuscito, l’anticorpo secondario intaserà specificamente la posizione dell’epitopo specifico in verde brillante, in modo coerente, consentendo la caratterizzazione della composizione della parete cellulare in una certa fase di sviluppo della cellula, del tessuto o dell’organo. Ad esempio l’anticorpo LM6 ha un’alta affinità per 1,5-arabinan, un composto con rhamnogalacturonan di tipo I che può essere trovato abbondantemente etichettando la parete cellulare dell’anther Quercus suber in via di …

Discussion

Il metodo di immunolocalizzazione fluorescente nelle piante qui descritto, sebbene perfettamente semplice, si basa sul successo di diversi piccoli passaggi. Il primo dei quali è la preparazione e la fissazione del campione. Durante questo primo passaggio, una miscela di formaldeide e glutaraldeide viene utilizzata per collegare la maggior parte dei componenti cellulari. La formaldeide nella soluzione fornisce una fissazione lieve e reversibile mentre la glutaraldeide fornisce un forte collegamento più permanente; l’equ…

Materials

25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)