식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화
Summary
이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.
Abstract
식물 발달은 내부 및 외부 자극에 대한 응답으로 세포벽 조성 및 구조의 지속적인 조정을 포함한다. 세포벽은 단백질, 페놀 화합물 및 물과 함께 셀룰로오스 및 비 셀룰로오스 다당류로 구성됩니다. 세포벽의 90%는 다당류(예를 들어, 펙틴) 및 아라비노갈락탄 단백질(AGP)으로 구성된다. 식물 조직학적 섹션에서 특정 글리칸 에피토프의 형광 면역 국소화는 벽 다당류 네트워크, 구조 및 구성 요소의 리모델링을 발견하는 핵심 도구로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 식물 조직에서 AGPs와 펙틴에서 글리칸 에피토프를 검출하기 위해 최적화 된 형광 면역 국소화 절차를보고합니다. 파라포름알데히드/글루타랄데히드 고정은 식물 샘플의 LR-White 포함과 함께 사용되어 조직 구조 및 조성물의 더 나은 보존을 가능하게 하였다. 초미세토메로 수득된 임베디드 샘플의 얇은 섹션은 특정 항체를 이용한 면역지역화를 위해 사용되었다. 이 기술은 뛰어난 해상도, 높은 특이성 및 동일한 샘플에서 여러 글리칸 에피토프를 감지 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 기술은 글리칸의 세포 세포 소중화를 허용하고 세포벽에 축적의 그들의 수준을 검출합니다. 또한 발달 과정에서 AGP 및 펙틴 분포의 현수체 패턴의 결정을 허용합니다. 이 도구의 사용은 궁극적으로 연구 방향을 안내하고 식물의 특정 기능에 글리칸을 연결할 수 있습니다. 더욱이, 얻어진 정보는 생화학적 및 유전자 발현 연구를 보완할 수 있다.
Introduction
식물 세포벽은 다당류와 당단백질로 구성된 복잡한 구조입니다. 세포벽은 세포유형, 국소화, 발달단계, 외부 및 내부 자극1에따라 건축, 조직 및 구성이 변화하는 매우 역동적인 구조이다. 아라비노갈락탄 단백질(AgPs)과 펙틴은 식물 세포벽의 중요한 성분입니다. AGP는 매우 글리코화 단백질이며펙틴은 상이한 식물 발달 단계2,3,4동안 조성물, 양 및 구조가 크게 변화하는 균질균투로난 다당류이다. AgPs와 펙틴 연구는 프로그램 된 세포 죽음, 무생물 스트레스에 대한 반응, 성적 식물 번식, 많은 다른 사람의 사이에서5와같은 여러 식물 프로세스에 참여한 것으로 나타났습니다. 이 연구의 대부분은 면역 지역화 연구 결과에서 얻은 정보로 시작했습니다.
복잡성을 감안할 때 세포벽연구에는 다양한 도구가 필요합니다. 단일 클론 항체 (mAbs)를 사용하여 글리칸 에피토페를 검출하는 것은이 구조를 따라 다당류 및 당단백질 분포를 해결하는 귀중한 접근 방식입니다. 글리칸 에피토프를 검출할 수 있는 mAbs의 큰 컬렉션이 있으며 각 mAb의 특이성은지속적으로6개뿐만 아니라 지속적으로 개선되고 있다. 여기에 설명 된 기술은 모든 식물 종에 적용 할 수 있으며, 더 비싸고 복잡한 기술을 포함 할 수있는 미래의 연구 방향을 안내하는 완벽한 도구입니다.
이 기술에서, 특정 항체는 FITC (형광이소 이소티오네이트), TRITC (테트라메틸로다민-5-(및 6)-이소티오카네이트) 또는 몇몇 알렉사 플루오르 염료와 같은 형광염염에 화학적으로 공해된다. 면역 형광은 형광 현미경으로 직접 관찰 할 수있는 글리칸의 명확하고 빠른 세포 전산화를 허용하는 몇 가지 장점을 제공합니다. 시료의 제조가 항원의 자연적인 구조를 효과적으로 보호할 수 있기 때문에, 더 낮은 양으로 존재하는 경우에도 매우 특이적이고 민감하다. 그것은 동일한 샘플에서 여러 항원검출을 허용하고 가장 중요한, 높은 품질과 시각적으로 아름다운 결과를 제공합니다. 형광 면역 지역화 연구에 의해 제공되는 큰 힘에도 불구하고, 그들은 종종 절차의 다른 단계의 시각화를 허용하는 상세한 프로토콜의 부족으로 인해 수행하고 구현하기 어려운 것으로 간주됩니다. 여기에서는 이 기술을 수행하는 방법과 고품질 이미지를 얻는 방법에 대한 몇 가지 간단한 지침을 제공합니다.
여기에 제시된 프로토콜의 경우 가장 적절한 고정을 사용하여 샘플을 먼저 수정하고 포함시켜야 합니다. 시간이 많이 걸리고 비교적 지루한 기술로 간주되지만 식물 샘플의 적절한 고정 및 포함은 성공적인 면역 지역화 분석법을 보장하는 열쇠입니다. 이 목적을 위해, 가장 일반적인 알데히드 처럼 교차 고정제를 사용 하 여 화학 고정. 교차 연결 고정제 조직의 분자 사이의 화학 결합을 설정, 안정화 및 샘플을 경화. 포름알데히드와 글루타랄데히드는 교차 연결 고정제이며, 때로는 두 고정제의 혼합이7을사용한다. 포름알데히드는 조직의 훌륭한 구조적 보존을 제공하고 오랜 시간 동안 작은 조직 후퇴를 생성하고 면역 염색과 호환됩니다. 글루타랄데히드는 포름알데히드와 함께 일반적으로 사용되는 강하고 안정적인 고정제입니다. 글루타랄데히드의 사용은 일부 특이한 라벨을 생성할 수 있는 고정 된 조직에 일부 무료 알데히드 그룹을 도입할 때 고려해야 할 몇 가지 단점이 있습니다. 또한 단백질과 다른 분자 사이의 교차 연결은 때때로 항체를 위해 접근할 수 없는 몇몇 표적 전형체를 렌더링할 수 있습니다. 이를 방지하려면 고정의 수량과 기간을 신중하게 정의해야 합니다.
고정 후 샘플을 적절한 수지에 내장하여 단면을 얻기 전에 경화합니다. 런던 수지 (LR-화이트) 아크릴 수지는 면역 지역화 연구를위한 선택의 수지입니다. 다른 수지와는 달리, LR-White는 친수성, 항원에 도달 하는 항 원을 허용, 그것을 용이 하 게 어떤 치료의 필요 없이. LR-White는 또한 낮은 자동 형광을 제공하여 면역 형광 이미징 중 배경 소음을 줄이는 장점이 있습니다.
알시안 블루 스테인링, 토루이딘 블루 스테인링 또는 주기적인 산-쉬프(PAS) 염색과 같은 세포벽의 다양한 성분을 검출할 수 있는 많은 염색 기술이 있다. 이들 중 어느 것도 면역 지역화 분석8의힘을 제공하지 않습니다. 이 접근법은 글리칸 검출에 더 큰 특이성을 제공하여 세포벽 조성 및 구조에 관한 광범위한 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 식물의 형광 면역 지역화 방법은 원활하게 간단하면서도 여러 개의 작은 단계의 성공에 의존합니다. 첫 번째는 샘플 준비 및 고정입니다. 이 첫 번째 단계 동안, 포름알데히드와 글루타랄데히드의 혼합물은 세포 성분의 대부분을 교차 연결하는 데 사용된다. 용액의 포름알데히드는 부드럽고 뒤집을 수 있는 고정을 제공하며 글루타랄데히드는 더 영구적인 연결을 제공합니다. 두 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 H2020-MSCA-RISE-2015및 종자 바퀴 FCT PTDC / BIA-FBT / 27839 /2017에 의해 투자 된 EU 프로젝트 690946 ‘섹스 시드'(성적 식물 재생 – 종자 형성)로부터 지원을받았다. AMP는 유럽 연합의 MSCA-IF-2016 프로젝트(No. 753328)로부터 보조금을 받았습니다. MC는 FCT 박사 과정 보조금 SFRH/BD/111781/2015로부터 교부금을 받았다.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
Riferimenti
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
