Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais
Summary
Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.
Abstract
O desenvolvimento da planta envolve ajustes constantes da composição e estrutura da parede celular em resposta a estímulos internos e externos. As paredes celulares são compostas de polissacarídeos de celulose e não celulósicos, juntamente com proteínas, compostos fenólicos e água. 90% da parede celular é composta de polissacarídeos (por exemplo, pectinas) e proteínas arabinogalactanas (AGPs). A imunolocalização fluorescente de epítopos glicanos específicos em seções histológicas vegetais continua sendo uma ferramenta fundamental para descobrir a remodelagem de redes, estrutura e componentes de polissacarídeos de parede.
Aqui, relatamos um procedimento otimizado de imunolocalização fluorescente para detectar epítopos glicanos de AGPs e pectinas em tecidos vegetais. A fixação de paraformaldeído/glutaraldeído foi utilizada juntamente com a incorporação LR-White das amostras da planta, permitindo uma melhor preservação da estrutura e composição do tecido. Foram utilizadas seções finas das amostras incorporadas obtidas com ultra-microtódomo para imunolocalização com anticorpos específicos. Esta técnica oferece grande resolução, alta especificidade e a chance de detectar vários epítopos glicanos na mesma amostra. Esta técnica permite a localização subcelular de glicanos e detecta seu nível de acumulação na parede celular. Também permite a determinação de padrões espátulais-temporais de AGP e distribuição de pectina durante os processos de desenvolvimento. O uso desta ferramenta pode, em última análise, orientar as instruções de pesquisa e vincular glicocanos a funções específicas nas plantas. Além disso, as informações obtidas podem complementar estudos bioquímicos e de expressão genética.
Introduction
As paredes celulares das plantas são estruturas complexas compostas de polissacarídeos e glicoproteínas. As paredes celulares são estruturas extremamente dinâmicas cuja arquitetura, organização e composição variam de acordo com o tipo celular, localização, estágio de desenvolvimento, estímulos externos e internos1. Proteínas arabinogalactanas (AGPs) e pectinas são componentes importantes da parede celular vegetal. AgPs são proteínas altamente glicosylated e pectinas são polissacarídeos homogalacturoanos cuja composição, quantidade e estrutura variam muito durante diferentes estágios de desenvolvimento vegetal2,3,4. Estudos de AGPs e pectina revelaram seu envolvimento em diversos processos vegetais, como morte celular programada, resposta a estresses abióticos, reprodução sexual de plantas, entre muitos outros5. A maioria desses estudos começou com informações obtidas a partir de estudos de imunolocalização.
Dada a sua complexidade, o estudo das paredes celulares requer muitas ferramentas diferentes. A detecção de epítopos glicanos usando anticorpos monoclonais (mAbs) é uma abordagem valiosa para resolver a distribuição de polissacarídeos e glicoproteínas ao longo desta estrutura. Há uma grande coleção de mAbs disponíveis para detectar epítopos glicanos e a especificidade de cada mAb está sendo continuamente melhorada, bem como6. A técnica aqui descrita é aplicável a todas as espécies vegetais, e é uma ferramenta perfeita para orientar futuras direções de pesquisa que podem envolver técnicas mais caras e complexas.
Nesta técnica, anticorpos específicos são quimicamente conjugados a corantes fluorescentes como FITC (isotiocianato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(e 6)-isothionato) ou vários corantes de Fluor Alexa. A imunofluorescência oferece várias vantagens, permitindo uma localização subcelular clara e rápida de glicocanos que podem ser diretamente observados sob um microscópio de fluorescência. É altamente específico e sensível, uma vez que a preparação da amostra pode efetivamente proteger a estrutura natural do antígeno, mesmo que presente em quantidades menores. Permite a detecção de múltiplos antígenos na mesma amostra e, o mais importante, oferece resultados de alta qualidade e visualmente bonitos. Apesar do grande poder oferecido pelos estudos de imunolocalização da fluorescência, muitas vezes são considerados difíceis de executar e implementar provavelmente devido à falta de protocolos detalhados que permitem a visualização das diferentes etapas do procedimento. Aqui, fornecemos algumas diretrizes simples sobre como executar essa técnica e como obter imagens de alta qualidade.
Para o protocolo aqui apresentado, as amostras devem primeiro ser fixadas e incorporadas utilizando o fixador mais adequado. Embora considerada como uma técnica demorada e relativamente tediosa, a fixação adequada e a incorporação da amostra vegetal é a chave para garantir um ensaio de imunolocalização bem-sucedido. Para isso, o mais usual é a fixação química usando fixação de crosslinking, como aldeídos. Fixações transversais estabelecem ligações químicas entre moléculas do tecido, estabilizando e endurecendo a amostra. Formaldeído e glutaraldeído são fixativos transfronteiriços, e às vezes uma mistura de ambos os fixativos é usada7. O formaldeído oferece grande preservação estrutural dos tecidos e por longos períodos de tempo, produzindo pequenas retrações teciduais e sendo compatível com a imunosstaining. Glutaraldeído é um fixador mais forte e estável geralmente usado em combinação com formaldeído. O uso de glutaraldeído tem algumas desvantagens que devem ser levadas em conta, pois introduz alguns grupos de aldeído gratuitos no tecido fixo, o que pode gerar alguma rotulagem inespecífica. Além disso, a ligação cruzada entre proteínas e outras moléculas ocasionalmente pode tornar alguns epítopos alvo inacessíveis para os anticorpos. Para evitar isso, a quantidade e a duração da fixação devem ser cuidadosamente definidas.
Após a fixação, as amostras são incorporadas na resina adequada para endurecer antes de obter as seções. Resina de Londres (LR-White) resina acrílica é a resina escolhida para estudos de imunolocalização. Ao contrário de outras resinas, lR-White é hidrofílico, permitindo que os anticorpos cheguem aos seus antígenos, sem necessidade de qualquer tratamento para facilitar isso. O LR-White também tem a vantagem de oferecer baixa fluorescência automática, permitindo uma redução do ruído de fundo durante a imagem de imunofluorescência.
Existem muitas técnicas de coloração disponíveis para detectar diferentes componentes da parede celular, como coloração azul alciano, coloração azul toluidina ou coloração periódica de ácido -Schiff (PAS). Nada disso oferece o poder das análises de imunolocalização8. Essa abordagem dá maior especificidade na detecção de glicanos, oferecendo informações mais amplas sobre a composição e estrutura da parede celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de imunolocalização fluorescente nas plantas aqui descrito, embora perfeitamente simples, conta com o sucesso de vários pequenos passos. A primeira delas é a preparação e fixação da amostra. Durante este primeiro passo, uma mistura de formaldeído e glutaraldeído é usada para cruzar a maioria dos componentes celulares. O formaldeído na solução proporciona uma fixação leve e reversível, enquanto o glutaraldeído proporciona uma ligação forte e mais permanente; o equilíbrio entre os dois fixati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores receberam apoio do projeto da UE 690946 ‘SexSeed’ (Reprodução de Plantas Sexuais – Formação de Sementes) financiado pelo H2020-MSCA-RISE-2015 e pela SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. A AMP recebeu uma subvenção do projeto MSCA-IF-2016 da União Europeia (nº 753328). A MC recebeu uma bolsa de doutorado da FCT SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
Riferimenti
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
