במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בmacromolecular הצפיפות כדי ליצור מודל מחוץ לגוף האדם יפרטרופית רקמת צלקת הדומה בתנאים vivo. כאשר מעובדים בסביבה macromolecular צפופה, העור האנושי לגידולים התערוכה פנוטיפים, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ופונקציונלי מאפיינים דומים רקמת צלקת.
Abstract
זה הוכח כי ברקמות vivo הם צפופים מאוד על ידי חלבונים, חומצות גרעין, מבריאוציצירופנים, פוליסכרידים, וכו ‘. הפרוטוקול הבא מחיל את טכניקת הצפיפות הmacromolecular (MMC) כדי לחקות את הצפיפות הפיזיולוגית הזו באמצעות הוספת פולימרים ניטרליים (קרוקודרים) לתרביות תאים בתוך מבחנה. מחקרים קודמים באמצעות ficoll או תוספי כמו הקרודרים להפגין כי הביטוי של קולגן אני ו fibronectin ב WI38 ו-WS-1 קווי התא משופרים באופן משמעותי באמצעות הטכניקה MMC. עם זאת, טכניקה זו לא אומתה יפרטרופית העיקרי צלקת-הנגזר העור האדם פיברוהפיצוצים (hHSFs). כמו צלקות יפרטרופית נובע התצהיר מוגזם של קולגן, פרוטוקול זה שואפת לבנות קולגן עשיר במודל צלקת יפרטרופית מתורבת על ידי החלת הטכניקה MMC עם hHSFs. מודל זה ממוטב MMC הוכח להיות בעל דמיון רב יותר עם רקמת צלקת vivo בהשוואה למערכות מסורתיות דו-ממדי (2-D) מערכות תרבות התא. כמו-כן, הוא חסכוני, חסכוני בזמן, ורצוי מבחינה אתית בהשוואה למודלים חייתיים. לפיכך, המודל הממוטב המדווח כאן מציע מודל “בvivo” מתקדם למחקרים יפרטרופית הקשורים לצלקת.
Introduction
רקמת צלקת מייצגת את נקודת הקצה של תיקון רקמות. עם זאת, אנשים רבים, במיוחד אלה הסובלים כוויות או טראומה1, הצטלקות יכולה להיות מוגזמת ולהטיל השפעות לא רצויות על מורפולוגיה ותפקוד של העור נרפא. למרות המנגנון המדויק של פתולוגי (צלקות יפרטרופית ו keloids) היווצרות צלקת לא מובנים לחלוטין, הפקדת מוגזמת של קולגן במהלך ריפוי הפצע הוכח להיות תרומה חיונית2.
הוא מבוסס היטב כי שינוי גורם הצמיחה ביתא 1 (tgf-β1) ו אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA) לשחק תפקידי מפתח בהיווצרות של יפרטרופית צלקות. הראיות מצביעות על כך מוגבה TGF-β1 ישירות מעוררת הפקדת מוגזמת של קולגן באמצעות ויסות SMAD איתות מסלול3. בנוסף, αSMA נמצא לתרום היווצרות צלקת יפרטרופית על ידי ויסות התכווצות התא והאפיתל בתהליך ריפוי הפצע4. היעדר מתאים בתוך מבחנה ומודלים vivo הוא מכשול גדול כלפי פיתוח והערכת התערבויות וטיפולים לשיקום צלקת. מטרת מחקר זה היא לנצל את הטכניקה הקיימת של MMC כדי לבנות “בvivo כמו” יפרטרופית צלקת מודל המתאים להערכת הרומן המתעוררים צלקת התערבויות הקשורות.
שחזור רקמות החיים מחוץ לגוף היה מטרה במשך שנים בקהילה המדעית. התפתחות בטכניקות החוץ-גופית בתחילת המאה ה-20 השיגה מטרה זו. הנוכחי טכניקות מבחנה התפתחו מעט מן ההפגנה המקורית של רו כי תאים עובריים יכולים לשרוד לשעבר vivo למשך מספר ימים בתמיסת מלח חם5. עם זאת, במתודולוגיות חוץ-גופית מוגבלים בעיקר לסוגי תאים בודדים המעובדים ב-2-D ואינם מvivo באופן מדויק רקמות בלתי מוגבלות. בעוד שימושי לבדיקת ביוכימיה תא, פיזיולוגיה וגנטיקה, רקמות מקוריות הן תלת-ממד ולשלב סוגי תאים מרובים. 2-D פשוט במערכות מבחנה הנושאים תאים מיונקים לסביבות מלאכותיות מאוד שבו הארכיטקטורה המקורית ספציפית רקמות הוא איבד6. בתורו, זה משפיע על אירועים תאיים ומסחטות, וכתוצאה מכך מורפולוגיה התא נורמלי, פיזיולוגיה, התנהגות7.
הריבית מאחורי פרוטוקול זה טמונה בפיתוח וניהול קליני של צלקות יפרטרופית ו keloids. בעוד הוא מבוסס היטב כי העור שפיברותקיעות אחראים במידה רבה לייצור שופע של collagens הנוכחי ברקמת צלקת, טיפוח פיברותקיעות העור באמצעות 2-D במערכות מבחנה נכשלת לשכפל את תחלופת הקולגן נצפתה ב vivo8. מודרני בשיטות מבחנה עדיין למעשה להשתמש “מלוחים חמים”, סביבה שונה לחלוטין מזה ברקמות החיים. רקמות בvivo הם צפופים מאוד, עם חלבונים, חומצות גרעין, הריבונצירופדים, ו פוליסכרידים, הכובש 5% – 40% של נפח הכולל. כפי שאין שתי מולקולות יכול לכבוש את אותו החלל באותו זמן, יש מעט שטח פנוי זמין והעדר כמעט מוחלט של מים חינם9.
טכניקת ה-MMC מטילה אילוצים המשפיעים על המאפיינים התרמודינמיים של הנוזל הציטוזול והביניים. אינטראקציות מולקולריות, מכלולי קולטן לליטרים ואותות, אנזימים ואורגלים, מוגבלים ומוגבלות מאינטראקציה באופן חופשי9. אינטראקציות בתוך הסביבה הפראיסלנדי (כלומר, interstitium) גם הן מאולצת. הראיות האחרונות מאשרות כי ריכוזים גבוהים של קרו אינרטי פתרונות צפופים perturb דיפוזיה, האגודה הפיזית, צמיגות ונכסים הידרודינמיים10.
מעניין, מספר סוכני הצפיפות הפופולריים (כלומר, Ficoll dextran, polyvinylrolidone [PVP], ו נתרן 4-styreneסולפיאט [PSS]) אינם שקולים כאשר מוחלים על סוגי תאים שונים ובהגדרות שונות. במחקר קודם, פיקדול דווח להיות פחות ציטוטוקסיים עבור תאי גזע mesenchymal לעומת PVP. תוצאות אלו הפרדרו להיות תוצאה של המטען הנייטרלי ורדיוס הידרודינמי קטן יחסית11. לעומת זאת, המחקר השני מצא כי תוספי יעיל יותר בגירוי קולגן אני התצהיר על ידי הריאות האדם פיברופיצוצים לעומת ficoll12. נתונים מתוך המחקר שלנו עולה כי Ficoll מגביר את התצהיר הקולגן על ידי יפרטרופית הצלקת נגזר פיברופיצוצים, בעוד PVP הוא רעיל תאים אלה13.
הוכח כי ההמרה של procollagen לקולגן הוא מהיר יותר בסביבה מאוד vivo14, בעוד שיעור התגובות הביולוגי מתעכב במערכת התרבות 2-D מדולל15. יש לנו אופטימיזציה בפרוטוקול מבחנה כאן, שילוב של MMC כדי להראות את הטיפוח של הכדורים העורי משמש כמו יותר “בvivo-כמו” מודל פיברוזיס העורי והיווצרות צלקת. בניגוד למערכת התרבות הדו המשותפת, טיפוח ה-hHSFs עם MMC מעורר את הביוסינתזה והפקדת הקולגן באופן משמעותי13. בעיקר, מאפיינים אחרים של סיסטיק (כלומר, ביטוי מוגבר של מטריקס מטאלוטיות [MMPs] ו ציטוקינים proinflammatory) ניכרים גם תחת פרוטוקול MMC זה אופטימיזציה13. כאשר מעובד בשיטה זו, הוא מוצג כי התאים העורי לכידה של הפרמטרים הפיסיולוגיים, ביוכימיים, פונקציונלי הנמדד vivo.
MMC אופטימיזציה בפרוטוקול מבחנה שימש כדי להעריך את הביטוי של קולגן ו חלבונים ecm אחרים על ידי העור פיברותקיעות מבודדים מיפרטרופית צלקת דרמיס ולא מעורב דרמיס הסמוכים. כאשר מעובדים בסביבות MMC בתוך מבחנה, זה כבר נצפתה כי hHSFs לבטא מאפיינים מסוימים (כלומר, mRNA, ביוכימיה, פיזיולוגיה, ו-פנוטיפ) דומה יפרטרופית רקמת צלקת בvivo. הראיות מצביעות על כך שתכונות פיזיות וכימיות הן שיקולים חשובים בעת בחירת מקרודרים ואופטימיזציה של תנאי MMC לצורך טיפוח-תרגול.
לצורך הוכחת העיקרון, פרוטוקול MMC מוחל כאן כדי להעריך ולכמת את היכולת של Shikonin ואת האנלוגיות שלה כדי לגרום אפופטוזיס. זה מאפשר הערכה של יישומים פוטנציאליים של אלה באופן טבעי-נגזר הרפואה הסינית המסורתית (TCM) תרכובות עבור ניהול עורי הצטלקות13. על אף, הפשטות, העלות והאפקטיביות והדייקנות של זה בפרוטוקול MMC מספק גם את התקנות האחרונות לחיסול ניסויים ביונקים על ידי הדירקטיבה של האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי וארה ב. הסוכנות להגנת הסביבה (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה נועד למטב ולאמת שיפור: צלקת-in-a-צנצנת מודל בלתי מתורבת לרקמת צלקת אנושית. מחקרים קודמים דיווחו על היישום של הטכניקה של MMC לריאות האדם פיברותקיעות12, מח עצם האדם mesenchymal גזע התאים23, ואת הגוף האנושי פיברופיצוצים23 באמצעות תוספי12, fico…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מימון של הסוכנות של סינגפור למדע, טכנולוגיה ומחקר “SPF 2013/004: ביולוגיה של העור מחקר בסיסי” ואת “טיפוח הפצע חדשנות עבור הטרופיקס” חיל האוויר-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. המחברים הכירו בהכרת תודה ובסיוע ד ר פאולה בני וד ר מיכאל ראע’בט.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Riferimenti
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
