In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding
Summary
Questo protocollo descrive l’uso dell’affollamento macromolecolare per creare un modello di tessuto ipertrocico umano in vitro che assomiglia in condizioni di vivo. Quando coltivati in un ambiente macromolecolare affollato, i fibroblasti della pelle umana presentano fenotipi, biochimica, fisiologia e caratteristiche funzionali simili al tessuto cicatriziale.
Abstract
È stato dimostrato che i tessuti in vivo sono molto affollati da proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine, polisaccharide, ecc. Il seguente protocollo applica una tecnica di crowding macromolecolare (MMC) per imitare questo affollamento fisiologico attraverso l’aggiunta di polimeri neutri (crowders) alle colture cellulari in vitro. Studi precedenti che utilizzano Ficoll o dextran come crowder dimostrano che l’espressione del collagene I e della fibronectina nelle linee cellulari WI38 e WS-1 è notevolmente migliorata utilizzando la tecnica MMC. Tuttavia, questa tecnica non è stata convalidata nei fibroblasti cutanei umani ipertrofici primari (hHSF). Poiché le cicatrici ipertrofiche derivano dall’eccessiva deposizione di collagene, questo protocollo mira a costruire un modello di cicatrice ipertrotro ricco di collagene applicando la tecnica MMC con hHSFs. Questo modello MMC ottimizzato ha dimostrato di possedere più somiglianze con il tessuto cicatriziale in vivo rispetto ai tradizionali sistemi di coltura cellulare 2-D. Inoltre, è conveniente, efficiente in termini di tempo ed eticamente desiderabile rispetto ai modelli animali. Pertanto, il modello ottimizzato riportato qui offre un modello avanzato “in vivo” per studi ipertrofici correlati alle cicatrici.
Introduction
Il tessuto cicatriziale rappresenta il punto finale della riparazione dei tessuti. Tuttavia, in molti individui, specialmente quelli che soffrono di ustioni o traumi1, le cicatrici possono essere eccessive e impongono effetti indesiderati sulla morfologia e sul funzionamento della pelle guarita. Anche se i meccanismi esatti di formazione di cicatrici patologiche (cicatrici ipertrofiche e cheloidi) non sono completamente compresi, l’eccessiva deposizione di collagene durante la guarigione delle ferite è stata dimostrata essere un contributo essenziale2.
È ben noto che la trasformazione del fattore di crescita beta 1 (TGF-1) e dell’actina muscolare liscia alfa (ZMA) svolge un ruolo chiave nella formazione di cicatrici ipertrofiche. L’evidenza suggerisce che l’elevato TGF-1 stimola direttamente l’eccessiva deposizione di collagene regolando il percorso di segnalazione SMAD3. Inoltre, è stato trovato che l’sMA contribuisce alla formazione di cicatrici ipertrofiche regolando la contrazione cellulare e la reetilizzazione nel processo di guarigione della ferita4. La mancanza di modelli in vitro e in vivo adatti è un grave ostacolo allo sviluppo e alla valutazione di interventi e terapie per la correzione delle cicatrici. Lo scopo di questo studio è quello di utilizzare la tecnica MMC esistente per costruire un modello di cicatrice ipertrofica “in vivo” adatto per la valutazione di nuovi ed emergenti interventi legati alla cicatrice.
Riprodurre tessuto vivente al di fuori del corpo è stato un obiettivo per anni nella comunità scientifica. Lo sviluppo di tecniche in vitro all’inizio del ventesimo secolo ha in parte raggiunto questo obiettivo. Le attuali tecniche in vitro si sono leggermente evolute rispetto alla dimostrazione originale di Roux che le cellule embrionali possono sopravvivere all’esagono per diversi giorni in calda salina5. Tuttavia, le metodologie in vitro sono per lo più limitate atipi di cellule singole coltivati in 2D e non ricapitolano accuratamente i tessuti in vivo. Sebbene siano utili per esaminare la biochimica cellulare, la fisiologia e la genetica, i tessuti nativi sono 3D e incorporano più tipi di cellule. I sistemi in vitro 2D semplici sottopongano le cellule dei mammiferi ad ambienti altamente artificiali in cui l’architettura nativa specifica del tessuto viene persa6 . A sua volta, questo colpisce eventi intracellulari ed extracellulari, con conseguente morfologia cellulare anormale, fisiologia e comportamento7.
L’interesse alla base di questo protocollo sta nello sviluppo e nella gestione clinica di cicatrici e cheloidi ipertrofi. Mentre è ben noto che i fibroblasti dermici sono in gran parte responsabili dell’abbondante produzione di collageni presenti nel tessuto cicatriziale, coltivando fibroblasti dermici utilizzando sistemi 2D in vitro non riesce a riprodurre il turnover di collagene osservato in vivo8. I metodi in vitro contemporanei usano ancora essenzialmente la “calda salina”, un ambiente completamente diverso da quello dei tessuti viventi. I tessuti in vivo sono estremamente affollati, con proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine e polisaccaridi, che occupano il 5-40% del volume totale. Poiché non ci sono due molecole che possono occupare lo stesso spazio allo stesso tempo, c’è poco spazio libero disponibile e una quasi completa assenza di acqua libera9.
La tecnica MMC impone vincoli che influenzano le proprietà termodinamiche del citosol e dei fluidi interstiziali. Le interazioni molecolari, i complessi di segnalazione recettore-ligando, gli enzimi e gli organelli sono confinati e limitati dall’interazione libera9. Anche le interazioni all’interno dell’ambiente pericellulare (cioè l’interstizio) sono vincolate. Recenti evidenze confermano che alte concentrazioni di macromolecole ineret in soluzioni affollate perturbno la diffusione, l’associazione fisica, la viscosità e le proprietà idrodinamiche10.
È interessante notare che diversi agenti di affollamento popolari (ad esempio, Ficoll, dextran, poliviglierino-PVP] e sodio 4-styrenesulfonate [PSS]) non sono equivalenti se applicati a diversi tipi di cellule e in diverse impostazioni. In uno studio precedente, Ficoll è stato segnalato per essere meno citotossico per le cellule staminali mesenchymiche rispetto al PVP. Questi risultati sono stati interpretati come la conseguenza della sua carica neutra e del raggio idrodinamico relativamente piccolo11. Al contrario, un secondo studio ha trovato che dextran è più efficace nello stimolare il collagene I deposizione da fibroblasti polmonari umani rispetto a Ficoll12. I dati del nostro studio suggeriscono che Ficoll migliora la deposizione di collagene da fibroblasti ipertrofici derivati da cicatrici, mentre il PVP è tossico per queste cellule13.
È stato dimostrato che la conversione del procollagene al collagene è più veloce in un ambiente in vivo molto affollato14, mentre il tasso di reazioni biologiche è ritardato in un sistema di coltura 2D diluito15. Abbiamo ottimizzato il protocollo in vitro qui, incorporando MMC per mostrare la coltivazione di fibroblasti dermici che servono come un modello più “in vivo” per la fibrosi dermica e la formazione di cicatrici. In contrasto con il sistema di coltura 2D comune, coltivare hHSF con MMC stimola significativamente la biosintesi e la deposizione di collagene13. In particolare, altre caratteristiche della fibrosi (cioè una maggiore espressione delle metalloproteine di matrice [MMP] e delle citochine infiammatorie) sono evidenti anche in questo protocollo MMC ottimizzato13. Quando coltivate con questo metodo, si ha dimostrato che le cellule dermiche ricapitolano i parametri fisiologici, biochimici e funzionali misurati in vivo.
Il protocollo MMC in vitro ottimizzato è stato utilizzato per valutare l’espressione del collagene e di altre proteine ECM da fibroblasti dermici isolati da dermi cicatrici ipertrofi e dermi sconnessi adiacenti non coinvolti. Quando viene coltivato in ambienti MMC in vitro, è stato osservato che hHSF esprimono determinate caratteristiche (ad esempio, mRNA, biochimica, fisiologia e fenotipo) simili al tessuto lecito ipertrofico dermifico in vivo. Le prove indicano che le proprietà fisiche e chimiche sono considerazioni importanti quando si selezionano i crowder e si ottimizzano le condizioni MMC per la coltivazione in vitro.
Per il proof-of-principle, il protocollo MMC viene qui applicato per valutare qualitativamente e quantitativamente la capacità di Shikonin e dei suoi analoghi di indurre l’apoptosi. Ciò consente di valutare le potenziali applicazioni di questi composti di medicina tradizionale cinese (TCM) derivati naturalmente per la gestione delle cicatrici dermiche13. Nonostante ciò, la semplicità, l’efficacia in termini di costi e la tempestività di questo protocollo MMC in vitro soddisfano anche le recenti normative volte ad eliminare la sperimentazione nei mammiferi da parte della direttiva UE 2010/63/EU e dell’Agenzia per la protezione dell’ambiente degli Stati Uniti (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo mira a ottimizzare e autenticare un modello in vitro migliorato:scar-in-a-jar per il tessuto cicatriziale cutaneo umano. Studi precedenti hanno segnalato l’applicazione della tecnica MMC ai fibroblasti polmonari umani12, cellule staminali mesenchymiche del midollo osseo umano23e fibroblasti dermici umani23 utilizzando dextran12, Ficoll12e PVP23 come crowder. Nel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell’Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca di Singapore “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” e della “Wound Care Innovation for the Tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Gli autori riconoscono con gratitudine i consigli e l’assistenza del Dr. Paula Benny e del Dr. Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Riferimenti
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