Questo protocollo descrive l'uso dell'affollamento macromolecolare per creare un modello di tessuto ipertrocico umano in vitro che assomiglia in condizioni di vivo. Quando coltivati in un ambiente macromolecolare affollato, i fibroblasti della pelle umana presentano fenotipi, biochimica, fisiologia e caratteristiche funzionali simili al tessuto cicatriziale.
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Articolo metodologico
In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato dimostrato che i tessuti in vivo sono molto affollati da proteine, acidi nucleici, ribonucleoproteine, polisaccharide, ecc. Il seguente protocollo applica una tecnica di crowding macromolecolare (MMC) per imitare questo affollamento fisiologico attraverso l'aggiunta di polimeri neutri (crowders) alle colture cellulari in vitro. Studi precedenti che utilizzano Ficoll o dextran come crowder dimostrano che l'espressione del collagene I e della fibronectina nelle linee cellulari WI38 e WS-1 è notevolmente migliorata utilizzando la tecnica MMC. Tuttavia, questa tecnica non è stata convalidata nei fibroblasti cutanei umani ipertrofici primari (hHSF). Poiché le cicatrici ipertrofiche derivano dall'eccessiva deposizione di collagene, questo protocollo mira a costruire un modello di cicatrice ipertrotro ricco di collagene applicando la tecnica MMC con hHSFs. Questo modello MMC ottimizzato ha dimostrato di possedere più somiglianze con il tessuto cicatriziale in vivo rispetto ai tradizionali sistemi di coltura cellulare 2-D. Inoltre, è conveniente, efficiente in termini di tempo ed eticamente desiderabile rispetto ai modelli animali. Pertanto, il modello ottimizzato riportato qui offre un modello avanzato "in vivo" per studi ipertrofici correlati alle cicatrici.
Introduzione
Il tessuto cicatriziale rappresenta il punto finale della riparazione dei tessuti. Tuttavia, in molti individui, specialmente quelli che soffrono di ustioni o traumi1, le cicatrici possono essere eccessive e impongono effetti indesiderati sulla morfologia e sul funzionamento della pelle guarita. Anche se i meccanismi esatti di formazione di cicatrici patologiche (cicatrici ipertrofiche e cheloidi) non sono completamente compresi, l'eccessiva deposizione di collagene durante la guarigione delle ferite è stata dimostrata essere un contributo essenziale2.
È ben noto che la trasformazione del fatt....
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Protocollo
1. Cultura cellulare
- Mantenere hHSF e normali fibroblasti dermici derivati da tessuto non patologico (hNSF) nel mezzo modificato dell'Aquila (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS) e l'1% v/v di soluzione di penicillina/streptomicina (P/S) a 37 gradi centigradi in un incubatore con 5% di CO2/95%.
- Acquistare Ficoll 70, Ficoll 400 e acido ascorbico dalle società appropriate.
2. Costruzione del modello MMC di cicatrici ipertrofice
- Seme le hHSFs o hNSF (50.000/bene) in una piastra da 24 pozze contenente 1 mL di supporti in ogni pozzo.
- Mettere in un'incubatric....
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Risultati
Sono stati eseguiti campioni triplicati in ogni esperimento e ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte utilizzando cellule di tre singoli pazienti. I dati sono espressi come percentuali del gruppo di controllo. Il test post-hoc di ANOVA e Tukey è stato applicato unidirezionale per analizzare le differenze statistiche(p .0,05).
MMC utilizzando Ficoll al 9% FVO (occupazione del volume frazionario) migliora la quantità totale di collagene e collagene I deposizione in hHSF
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Discussione
Questo protocollo mira a ottimizzare e autenticare un modello in vitro migliorato:scar-in-a-jar per il tessuto cicatriziale cutaneo umano. Studi precedenti hanno segnalato l'applicazione della tecnica MMC ai fibroblasti polmonari umani12, cellule staminali mesenchymiche del midollo osseo umano23e fibroblasti dermici umani23 utilizzando dextran12, Ficoll12e PVP23 come crowder. Nel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca di Singapore "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" e della "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Gli autori riconoscono con gratitudine i consigli e l'assistenza del Dr. Paula Benny e del Dr. Michael Raghunath.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m filtro | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alfa actina muscolare liscia (&alfa;SMA) anticorpo primario | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (termociclatore) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Acido ascorbico | Wako | #013-12061 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Anticorpo primario del collagene I (per l'immunocolorazione) | Abcam | 6308 | |
| Anticorpo primario del collagene I (per western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Anticorpo primario del collagene III | Abcam | ab7778 | |
| Anticorpo primario del collagene IV | Abcam | ab6586 | |
| Rosso diretto 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH anticorpo primario | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Anticorpo secondario anti-coniglio di capra | Abcam | ab97050 | |
| Cicatrice ipertrofica umana/fibroblasti normali (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| Kit di sintesi iScript cDNA | Bio-Rad | #1708890 | |
| Anticorpo primario MMP-1 | Abcam | ab38929 | |
| Anticorpo primario MMP-13 | Abcam | ab39012 | |
| Anticorpo primario MMP-2 | Abcam | ab37150 | |
| Anticorpo primario MMP-9 | Abcam | ab38898 | |
| Spettrofotometri per microvolumi NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Membrana nitrocellulosica | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Gel proteici Bis-Tris | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Tampone bloccante Odyssey | LI-COR Biosciences | 927– Sistema di imaging Fc 40000 | |
| Odyssey | LI-COR Biosciences | N/A Microscopio | |
| Olympus IX-81 HCS (per immunocolorazione) | Olympus | N/A | |
| Soluzione di penicillina/streptomicina (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Saggi PrimePCR | Bio-Rad | Primer personalizzati pre-rivestiti in piastre a 96 pozzetti in base alle esigenze | |
| Cocktail di inibitori della proteasi (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| tampone RIPA | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Vanadato di sodio | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| sodio vanadato | Sigma-Aldrich 450243 | ||
| SpectraMax M5 Lettore di micropiastre multimodale | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Riferimenti
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail....
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Ristampe e permessi
