Generering av rekombinant rotavirus fra plasmid DNA gir et viktig verktøy for studiet av rotavirusreplikasjon og patogenese, og utvikling av rotavirusuttrykksvektorer og vaksiner. Her beskriver vi en forenklet omvendt genetikk tilnærming for å generere rekombinant rotavirus, inkludert stammer som uttrykker fluorescerende reporter proteiner.
Rotavirus er en stor og utviklende populasjon av segmenterte dobbeltstrandede RNA-virus som forårsaker alvorlig gastroenteritt hos unge av mange pattedyr og fugleiske vertsarter, inkludert mennesker. Med den nylige advent av rotavirus omvendt genetikk systemer, Det har blitt mulig å bruke rettet mutagenesis å utforske rotavirus biologi, endre og optimalisere eksisterende rotavirus vaksiner, og utvikle rotavirus multitarget vaksine vektorer. I denne rapporten beskriver vi et forenklet omvendt genetikksystem som gjør det mulig å effektiv og pålitelig gjenoppretting av rekombinant rotavirus. Systemet er basert på kotransfection av T7 transkripsjon vektorer uttrykker full lengde rotavirus (+)RNAs og en CMV vektor koding en RNA capping enzym i BHK celler konstitutivt produsere T7 RNA polymerase (BHK-T7). Rekombinant rotavirus forsterkes ved å overvåke de transinfiserte BHK-T7-cellene med MA104-celler, en apenyrecellelinje som er svært tillatt for virusvekst. I denne rapporten beskriver vi også en tilnærming for å generere rekombinant rotavirus som uttrykker et eget fluorescerende reporterprotein gjennom innføringen av et 2A translasjonell stop-restart-element i genomsegment 7 (NSP3). Denne tilnærmingen unngår å slette eller modifisere noen av de virale åpne leserammene, slik at produksjonen av rekombinant rotavirus som beholder fullt funksjonelle virale proteiner samtidig som de uttrykker et fluorescerende protein.
Rotavirus er hovedårsakene til alvorlig gastroenteritt hos spedbarn og små barn, samt de unge av mange andre pattedyr og fuglearter1. Som medlemmer av Reoviridae-familien har rotavirus et segmentert dobbeltstrandet RNA (dsRNA) genom. Genomsegmentene finnes i en ikke-omsluttet icosahedral virion dannet av tre konsentriske lag av protein2. Basert på sekvensering og fylogenetisk analyse av genomsegmentene, er ni arter av rotavirus (A−D, F-J) definert3. Disse stammene bestående av rotavirus arter A er ansvarlig for det store flertallet av menneskelig sykdom4. Innføringen av rotavirusvaksiner i barnevaksinasjonsprogrammer som begynner i det siste tiåret, er korrelert med betydelige reduksjoner i rotavirusdødelighet og sykelighet. Spesielt har antall rotavirus-tilknyttede barnedødsfall gått ned fra ca. 528 000 i 2000 til 128 500 i 20164,5. Rotavirusvaksiner er formulert fra levende attenuerte stammer av viruset, med 2 til 3 doser administrert til barn med 6 måneders alder. Det store antallet genetisk varierte rotavirusstammer som sirkulerer hos mennesker og andre pattedyrarter, kombinert med deres evne til raskt å utvikle seg gjennom mutagenesis og reassortment, kan føre til antigene endringer i typer rotavirus som smitter barn6,7,8. Slike endringer kan undergrave effekten av eksisterende vaksiner, som krever erstatning eller modifikasjon.
Utviklingen av fullt plasmidbaserte revers genetikk systemer slik at manipulering av noen av de 11 rotavirus genom segmenter ble bare nylig oppnådd9. Med tilgjengeligheten av disse systemene har det blitt mulig å avdekke molekylære detaljer om rotavirusreplikasjon og patogenese, for å utvikle forbedrede screeningmetoder for høy gjennomstrømning for antirotavirusforbindelser, og for å skape nye potensielt mer effektive klasser av rotavirusvaksiner. Under rotavirus replikering, avkortet viral (+)RNAs ikke bare veilede syntesen av virale proteiner, men også tjene som maler for syntese av avkom dsRNA genom segmenter10,11. Alle rotavirus omvendt genetikk systemer beskrevet til dags dato stole på transfection av T7 transkripsjon vektorer i pattedyr celle linjer som en kilde til cDNA-avledet (+)RNAs brukes i å gjenopprette rekombinant virus9,12,13. Innenfor transkripsjonsvektorene er virale cDNAer i full lengde plassert mellom en oppstrøms T7-promoter og nedstrøms hepatitt deltavirus (HDV) ribozyme slik at virale (+)RNAer syntetiseres av T7 RNA polymerase som inneholder autentisk 5′ og 3′-termini (figur 1A). I første generasjons omvendt genetikk system, rekombinant virus ble gjort ved å transfecting baby hamster nyreceller uttrykker T7 RNA polymerase (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transkripsjon vektorer, hver reketisering av en unik (+)RNA av simian SA11 virus stamme, og tre CMV promotor-stasjonen uttrykk plasmids, en koding avian reovirus p10FAST fusjon protein og to koding underenheter av vaccinia virus D1R-D12L capping enzym kompleks9. Rekombinant SA11 virus generert i transfected BHK-T7 celler ble forsterket ved å overvåke med MA104 celler, en cellelinje tillatt for rotavirus vekst. En modifisert versjon av første generasjons omvendt genetikk system har blitt beskrevet som ikke lenger bruker støtte plasmids12. I stedet genererer det modifiserte systemet rekombinant rotavirus ganske enkelt ved å transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transkripsjon vektorer, med forbehold om at vektorer for viral fabrikken (viroplasm) byggeblokker (ikke-strukturelle proteiner NSP2 og NSP5) legges til på nivåer 3 ganger høyere enn de andre vektorer14,15. Modifiserte versjoner av det omvendte genetikksystemet er også utviklet som støtter utvinning av den menneskelige KU og Odelia stammer av rotavirus16,17. Rotavirusgenomet er bemerkelsesverdig mottagelig for manipulering av omvendt genetikk, med rekombinantvirus generert til dags dato med mutasjoner introdusert i VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, og NSP522,23. Blant de mest nyttige virusgenerert så langt er de som har blitt utviklet for å uttrykke fluorescerende reporter proteiner (FPs)9,12,21,24,25.
I denne publikasjonen gir vi protokollen for det omvendte genetikksystemet som vi bruker i laboratoriet vårt for å generere rekombinante stammer av SA11 rotavirus. Nøkkelfunksjonen i vår protokoll er co-transfection av BHK-T7 celler med 11 pT7 transkripsjon vektorer (modifisert til å inkludere 3x nivåer av pT7/NSP2SA11 og pT7/NSP5SA11 vektorer) og en CMV uttrykk vektor koding afrikanske svinefeber virus (ASFV) NP868R capping enzym21 (Figur 2). I våre hender fører tilstedeværelsen av NP868R plasmid til produksjon av høyere titers av rekombinantvirus av transinfiserte BHK-T7-celler. I denne publikasjonen gir vi også en protokoll for endring av pT7/NSP3SA11 plasmid slik at rekombinantvirus kan genereres som ikke bare uttrykker segment 7 proteinproduktet NSP3, men også en egen FP. Dette oppnås ved å re-engineering NSP3 åpen avlesningramme (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid å inneholde en nedstrøms 2A translational stop-restart element etterfulgt av en FP ORF (Figur 1B)24,26. Gjennom denne tilnærmingen har vi generert rekombinant rotavirus som uttrykker ulike FPs: UnaG (grønn), mKate (langt rød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan) og YFP (gul)24,27,28. Disse FP-uttrykkende rotavirusene er laget uten å slette NSP3 ORF, og dermed gi virus som forventes å kode et komplett komplement av fungerende virusproteiner.
I vårt laboratorium er vi rutinemessig avhengige av den omvendte genetikkprotokollen som er beskrevet her for å produsere rekombinant SA11 rotavirus. Med denne tilnærmingen gjenoppretter personer med liten erfaring i molekylærbiologiteknikker eller arbeider med rotavirus rekombinantvirus selv på deres første forsøk. Vi har generert nærmere 100 rekombinantvirus etter denne protokollen, inkludert de med genomer som har blitt re-konstruert for å uttrykke utenlandske proteiner (f.eks. FPs) og som inneholder sekvenst…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R03 AI131072 og R21 AI144881, Indiana University Oppstart Funding, og Lawrence M. Blatt Begavelse. Vi takker medlemmer av IU Rotahoosier-laboratoriet, Ulrich Desselberger og Guido Papa for deres mange bidrag og forslag til å utvikle den omvendte genetikkprotokollen.
Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
Chloroform | MP | 194002 | |
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |