Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Summary

Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å indusere aktiv eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) hos mus. En metode for isolasjon og karakterisering av infiltrerte lymfocytter i sentralnervesystemet (CNS) presenteres også for å vise hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.

Abstract

Multippel sklerose (MS) er en autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) forårsaket av kombinasjonen av miljøfaktorer og mottakelig genetisk bakgrunn. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en typisk sykdomsmodell av MS som er mye brukt til å undersøke patogenesen der T-lymfocytter spesifikke for myelinantigener initierer en inflammatorisk reaksjon i CNS. Det er svært viktig å vurdere hvordan lymfocytter i CNS regulerer utviklingen av sykdommen. Imidlertid er tilnærmingen for å måle mengden og kvaliteten på infiltrerte lymfocytter i CNS svært begrenset på grunn av vanskelighetene med å isolere og oppdage infiltrerte lymfocytter fra hjernen. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for det som er nyttig for isolasjon, identifisering og karakterisering av infiltrerte lymfocytter fra CNS og vil være nyttig for vår forståelse av hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.

Introduction

Som en kronisk demyeliniserende sykdom i CNS påvirker MS ca. 2,5 millioner mennesker over hele verden og mangler kurative behandlinger¹. Det regnes også som en autoimmun sykdom, hvor myelinantigenspesifikke T-lymfocytter initierer en inflammatorisk reaksjon og fører til demyelinasjon og axonal skade i CNS². Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) har blitt mye brukt til å undersøke patogene mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelinasjonssykdomsmodell i CNS³. Det er to måter å indusere EAE: en er å indusere EAE aktivt ved å immunisere dyr med myelinkomponenter, en annen er adoptivoverføring ved å overføre encefalitogene T-celler til^{reseptor 2,,4,,5}. Følsomheten for EAE er forskjellige i forskjellige dyrestammer⁶. I C57BL/6 mus induserer myelin oligodendrocyttglykoprotein (MOG) 35–55-utfordring en monofasisk sykdom med omfattende demyelinasjon og betennelse i CNS, som ofte brukes i eksperimenter med genmålrettede mus⁷.

Genereringen av myelinspesifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og utvikling av sykdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverte autoreaktive T-lymfocytter krysser blodhjernsbarrieren (BBB) inn i den sunne CNS og initierer EAE-sykdommen. Når MOG 35–55 Ag oppstår, induserer disse T-lymfocytene betennelse og rekruttering av effektorceller til CNS, noe som resulterer i demyelinasjon og aksonødeleggelse^8,9. I EAE-modellen er det rikelig med bevis for at nevroantigenspesifikke CD4⁺ T-celler kan initiere og opprettholde nevroinflammasjon og patologi^3,10. Avhengig av de store cytokinene som produseres, har CD4⁺ T-lymfocytter blitt klassifisert i forskjellige undergrupper: Th1 (preget av produksjon av interferon-γ), Th2 (preget av produksjon av interleukin 4), og Th17 (preget av produksjon av interleukin 17). Det antas at aktivering av Th1 og Th17 celler bidra til induksjon, vedlikehold og regulering av inflammatorisk demyelination i EAE og MS ved å skille ut effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til å aktivere makrofager og rekruttere nøytrofiler til de inflammatoriske stedene for å akselerere^{lesjonene 11}.

Fordi autoreaktive T-celler krysser BBB inn i CNS og induserer utviklingen av sykdom i MS og EAE, er det svært viktig å analysere T-celler i CNS. Det er imidlertid svært få etablerte protokoller for isolering av lymfocytter fra CNS¹². Derfor ble en metode optimalisert for å isolere mononukleære celler fra hjernen og analysere T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for strømningscytometri utviklet. Metoden bruker MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra og Pertussis Toxin Working Solution (PTX) for å indusere en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos mus. Deretter brukes mekanisk separasjon og tetthet gradient sentrifugeringsmetoder for isolering av CNS mononukleære celler. Til slutt brukes en optimalisert strømningscytometri gating strategi for å identifisere T-lymfocytter og undergrupper fra hjernen ved å farge flere markører.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av dyrekomiteen ved School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University. 1. Utarbeidelse av materialene Bruk MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-sekvensen av MOG35–55 for å få lyofilisert peptid fra kommersielle kilder. Kontroller at renheten på peptiden er >95%. Forbered 10 mg/ml MOG lageroppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS) og oppbevar ved -20 °C. Forbered en 4 mg/ml lagerløsning av M. tuberkulose H37…

Representative Results

Etter immunisering av C57BL/6-mus ble alle mus veid, undersøkt og gradert daglig for nevrologiske tegn. Det representative kliniske løpet av EAE bør resultere i en sykdomskurve som presentert i figur 2A og en endring av kroppsvekt i musen som presentert i figur 2B. C57BL/6-mus immunisert med MOG35-55 begynte vanligvis å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10–12 og oppnådde sykdomstoppen rundt dag 15–21 etter aktiv immunisering (figur…

Discussion

Denne studien presenterer en protokoll for å indusere og overvåke EAE ved hjelp av MOG35-55 i C57BL/6 mus, som regnes som en typisk nevroimmunologisk eksperimentell dyremodell av MS. EAE kan induseres varierende musstammer eller type protein som brukes til induksjon i henhold til formålet med studien. For eksempel kan bruk av PLP139-151 peptid hos SJL-mus indusere et residerende remitteringskurs for EAE-sykdom som er spesielt egnet for å vurdere terapeutiske effekter på tilbakefall¹⁵. Den eks…

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK