Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme
Summary
Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.
Abstract
Die Wasserstoff-Deuterium-Austauschmassenspektrometrie (HDX-MS) ist eine leistungsfähige Methode zur biophysikalischen Charakterisierung von Enzymkonformationsveränderungen und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen. Unter seinen vielen Vorteilen verbraucht HDX-MS nur geringe Mengen an Material, kann unter nahezu nativen Bedingungen ohne Enzym-/Substratkennzeichnung durchgeführt werden und kann räumlich aufgelöste Informationen über Enzymkonformationsdynamik liefern – auch für große Enzyme und Multiproteinkomplexe. Die Methode wird durch die Verdünnung des enzyms von Interesse in Puffer inD2O vorbereitet initiiert. Dies löst den Austausch von Protium in Peptidbindungsamiden (N-H) mit Deuterium (N-D) aus. An den gewünschten Austauschzeitpunkten werden Reaktions-Aliquots abgeschreckt, das Enzym in Peptide proteolysiert, die Peptide durch ultra-performance liquid chromatography (UPLC) getrennt und die Veränderung der Masse jedes Peptids (aufgrund des Austauschs von Wasserstoff gegen Deuterium) wird von MS aufgezeichnet. Die Menge der Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid hängt stark von der lokalen Wasserstoffbindungsumgebung dieses Peptids ab. Peptide, die in sehr dynamischen Regionen des Enzymaustauschdeuteriums sehr schnell vorhanden sind, während Peptide aus gut geordneten Regionen viel langsamer austauschen. Auf diese Weise berichtet die HDX-Rate über die lokale Enzymkonformationsdynamik. Störungen der Deuteriumaufnahme in Gegenwart verschiedener Liganden können dann verwendet werden, um Ligandenbindungsstellen zu kartieren, allosterische Netzwerke zu identifizieren und die Rolle der Konformationsdynamik in der Enzymfunktion zu verstehen. Hier veranschaulichen wir, wie wir HDX-MS verwendet haben, um die Biosynthese einer Art von Peptid-Naturprodukten namens Lanthipeptide besser zu verstehen. Lanthipeptide sind genetisch kodierte Peptide, die posttranslational durch große, multifunktionale, konformational dynamische Enzyme modifiziert werden, die mit traditionellen strukturbiologischen Ansätzen schwer zu studieren sind. HDX-MS bietet eine ideale und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der mechanistischen Eigenschaften dieser Enzymtypen.
Introduction
Proteine sind strukturell dynamische Moleküle, die verschiedene Konformationen auf Zeitskalen abtasten, die von Bindungsschwingungen im Femtosekundenmaßstab bis hin zu Umlagerungen ganzer Proteindomänen reichen, die über viele Sekunden auftreten können1. Diese Konformationsschwankungen sind oft kritische Aspekte der Enzym-/Proteinfunktion. So sind beispielsweise konforme Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, oft von entscheidender Bedeutung für die Modulation der Enzymfunktion, entweder durch die Organisation aktiver Standortrückstände, die für die Katalyse benötigt werden, die Definition von Substratbindungsstellen in sequenziellen kinetischen Mechanismen, die Abschirmung reaktiver Zwischenprodukte von der Umgebung oder durch Modulation der Enzymfunktion über allosterische Netzwerke. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass die konforme Dynamik während der gesamten Evolution konserviert werden kann und dass Störungen zu konservierten molekularen Bewegungen mit Veränderungen der Substratspezifität und der Entstehung neuer Enzymfunktionenkorreliertwerden können 2,3.
In den letzten Jahren hat sich die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) schnell als eine leistungsstarke Technik entwickelt, um zu untersuchen, wie Proteinkonformationslandschaften auf Störungen wie Ligandenbindung oder Mutagenese4,5,6,7reagieren. In einem typischen HDX-MS-Experiment (Abbildung 1) wird ein inD2O hergestelltes Protein in einen Puffer gegeben, der den Austausch von lösungsmittelaustauschbaren Protonen durch Deuteria auslöst. Die Wechselkursrate der Amid-Feuchtigkeit der Peptidbindungen hängt stark vom pH-Wert, der lokalen Aminosäuresequenz und der lokalen strukturellen Umgebung des Amids8ab. Amide, die mit Wasserstoffbindungswechselwirkungen (wie sie in α-Helices und β-Blättern vorhanden sind) tätig sind, tauschen sich langsamer aus als Amide in unstrukturierten Regionen des Proteins, die Massenlösungsmitteln ausgesetzt sind. Somit spiegelt das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die Struktur des Enzyms wider. Enzyme, die konform dynamisch sind oder bei Ligandenbindung strukturelle Übergänge durchlaufen, würden eine messbare HDX-Antwort liefern.
Die mechanistische Grundlage für den langsamen Wechselkurs eines strukturierten Amids ist in Abbildung 25,8,9dargestellt. Um HDX zu durchlaufen, muss der strukturierte Bereich zunächst eine entfaltete Konformation vorübergehend abtasten, so dass die Lösungsmittelmoleküle, die den HDX-Austausch über einen bestimmten säure-basenchemischen Mechanismus katalysieren, Zugang zum austauschbaren Amid haben. Letztlich bestimmen die relativen Größen des chemischen Wechselkurses (kchem) und die Falt- und Umfaltraten (koffen und kschließen) die im ExperimentgemesseneHDX-Rate 5,8. Aus diesem einfachen kinetischen Modell geht klar hervor, dass das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die zugrunde liegende Konformationsdynamik widerspiegelt (wie definiert durch koffen und kclose). Die meisten HDX-MS-Experimente werden in einem Bottom-up-Workflow durchgeführt, bei dem nach der Austauschreaktion das von Interesse kommende Protein in Peptide verdaut wird und die Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid als Erhöhung der Masse7gemessen wird. Auf diese Weise ermöglicht HDX-MS die Zuordnung von Störungen der Enzym-Konformationsdynamik auf der lokalen räumlichen Skala von Peptiden, sodass der Forscher beurteilen kann, wie die Störung die Dynamik in verschiedenen Regionen des Enzyms von Interesse verändert.
Die Vorteile des HDX-MS-Ansatzes zur Aufklärung der Proteinstrukturdynamik sind zahlreich. Zunächst kann die Methode mit kleinen Mengen an nativem Protein oder auf Proteinkomplexen in Systemen mit quartärer Struktur10durchgeführt werden. Es ist nicht einmal notwendig, dass die im Test verwendete Enzympräparation hochgereinigt wird11,12, solange der Bottom-up-HDX-MS-Workflow eine ausreichende Anzahl von sicher identifizierten Peptiden bietet, die die Proteinsequenz von Interesse abdecken. Darüber hinaus kann HDX-MS Informationen über konforme Dynamiken unter nahezu nativen Bedingungen bereitstellen, ohne dass eine standortspezifische Proteinkennzeichnung erforderlich ist, wie sie in Einzelmolekülfluoreszenzstudien13verwendet würde, und es gibt keine Größenbeschränkung für den Protein- oder Proteinkomplex, die untersucht werden kann (was Ansätze wie Kernspinresonanz [NMR] Spektroskopie schwierig macht)7,14. Schließlich können zeitaufgelöste HDX-MS-Methoden eingesetzt werden, um intrinsisch ungeordnete Proteine zu untersuchen, die mit Röntgenkristallographie15,16,17,18schwer zu untersuchen sind. Die Hauptbeschränkung von HDX-MS ist, dass die Daten von geringer struktureller Auflösung sind. HDX-MS-Daten sind nützlich, um darauf hinzuweisen, wo sich die Konformationsdynamik ändert, und um gekoppelte Konformationsänderungen aufzudecken, aber sie bieten oft nicht viel Einblick in den genauen molekularen Mechanismus, der die beobachtete Veränderung antreibt. Jüngste Fortschritte in der Kombination von Elektronenfang-Dissoziationsmethoden mit Protein-HDX-MS-Daten haben gezeigt, dass Austauschstellen zu einzelnen Aminosäurerückständen19zugeordnet werden können, aber nachfolgende biochemische und strukturelle Studien sind immer noch häufig erforderlich, um Klarheit für Strukturmodelle zu schaffen, die von HDX-MS-Daten übermittelt werden.
Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung eines HDX-MS-Assays vorgestellt20. Die nachstehend vorgestellten Probenvorbereitungsprotokolle sollten allgemein für jedes Protein gelten, das eine gute Löslichkeit in wässrigen Puffern aufweist. Speziellere Probenvorbereitungsmethoden und HDX-MS-Workflows stehen für Proteine zur Verfügung, als in Gegenwart von Waschmitteln oder Phospholipiden21,22,23,24untersucht werden müssen. Instrumentale Einstellungen für die HDX-MS-Datenerfassung werden für ein hochauflösendes Quadrupol-Massenspektrometer beschrieben, das an das Flüssigchromatographiesystem gekoppelt ist. Daten von ähnlicher Komplexität und Auflösung könnten auf einem der handelsüblichen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Systeme (LC-MS) gesammelt werden. Wichtige Aspekte der Datenverarbeitung mit einem kommerziell erhältlichen Softwarepaket werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Wir stellen auch Richtlinien für die Datenerhebung und -analyse vor, die mit den Empfehlungen der breiteren HDX-MS-Community12übereinstimmen. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die dynamischen strukturellen Eigenschaften von HalM2 zu untersuchen, einer Lanthipeptid-Synthetase, die die mehrstufige Reifung eines antimikrobiellen Peptids20katalysiert. Wir veranschaulichen, wie HDX-MS verwendet werden kann, um Substratbindungsstellen und allosterische Eigenschaften aufzudecken, die einer vorherigen Charakterisierung entgangen sind. Mehrere andere Protokolle zum Protein HDX-MS wurden in den letzten Jahren veröffentlicht25,26. Zusammen mit der vorliegenden Arbeit sollten diese früheren Beiträge dem Leser eine gewisse Flexibilität im experimentellen Design bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der in diesem Protokoll vorgestellte HDX-MS-Workflow bietet eine bemerkenswert robuste Plattform zur Kartierung der räumlichen Verteilung strukturdynamischer Elemente in Proteinen und zur Untersuchung, wie sich diese Dynamik als Reaktion auf Störungen (Ligandenbindung, Enzym-Mutagenese usw.) ändert. HDX-MS bietet mehrere deutliche Vorteile gegenüber anderen strukturbiologischen Ansätzen, die häufig zur Untersuchung der Konformationsdynamik verwendet werden. Vor allem werden nur geringe Mengen Aniis benötigt. Mithi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dem Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, der Canadian Foundation for Innovation und den Start-up-Fonds der McGill University unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
| potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
| DynamX | Waters | version 3.0 | |
| MassLynx | Waters | version 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Instrument and equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
Riferimenti
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