الأمثل لتسلسل وتحليل العينات FFPE-RNA المتدهورة
Summary
تصف هذه الطريقة الخطوات لتحسين جودة وكمية بيانات التسلسل التي يمكن الحصول عليها من عينات الحمض النووي الريبي (FFPE) المدمجة (FFPE) ذات البارافين. نحن نصف المنهجية لتقييم جودة عينات FFPE-RNA بدقة أكبر ، وإعداد مكتبات التسلسل ، وتحليل البيانات من عينات FFPE-RNA.
Abstract
يتيح تحليل التعبير الجيني من قبل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) رؤى فريدة في العينات السريرية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم ميكانيكي لأساس الأمراض المختلفة وكذلك آليات المقاومة و / أو قابلية التأثر. ومع ذلك ، فإن أنسجة FFPE ، التي تمثل الطريقة الأكثر شيوعًا للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة في العينات السريرية ، ليست أفضل المصادر لتحليل تنميط التعبير الجيني. غالبًا ما يكون الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من هذه العينات متدهورًا ومجزأً ومعدلًا كيميائيًا ، مما يؤدي إلى مكتبات تسلسل دون المستوى الأمثل. وفي المقابل، تولد هذه البيانات بيانات تسلسل رديئة الجودة قد لا تكون موثوقة لتحليل التعبير الجيني واكتشاف الطفرات. من أجل الاستفادة القصوى من عينات FFPE والحصول على أفضل البيانات الممكنة من عينات ذات جودة منخفضة ، من المهم اتخاذ بعض الاحتياطات أثناء التخطيط للتصميم التجريبي ، وإعداد مكتبات التسلسل ، وأثناء تحليل البيانات. وهذا يشمل استخدام المقاييس المناسبة لمراقبة جودة العينة الدقيقة (QC)، وتحديد أفضل الطرق لمختلف الخطوات أثناء إنشاء مكتبة التسلسل، ومراقبة الجودة مكتبة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطبيق أدوات برمجية ومعلمات صحيحة لتحليل بيانات التسلسل أمرًا بالغ الأهمية من أجل تحديد القطع الأثرية في بيانات RNA-seq ، وتصفية التلوث والقراءات منخفضة الجودة ، وتقييم توحيد التغطية الجينية ، وقياس قابلية استنساخ ملامح التعبير الجيني بين النسخ البيولوجية. يمكن أن تضمن هذه الخطوات دقة عالية وقابلية استنساخ لتنميط عينات الحمض النووي الريبي غير متجانسة للغاية. هنا نحن وصف الخطوات المختلفة لعينة مراقبة الجودة، وإعداد المكتبة ومراقبة الجودة، والتسلسل، وتحليل البيانات التي يمكن أن تساعد على زيادة كمية البيانات المفيدة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي منخفضة الجودة، مثل تلك التي تم الحصول عليها من أنسجة FFPE-RNA.
Introduction
وقد مكننا استخدام الجيل التالي من نهج التسلسل من جمع ثروة من المعلومات من أنواع مختلفة من العينات. غير أن العينات القديمة والمحفوظة بشكل سيئ لا تزال غير قابلة للتطبيق بالنسبة للأساليب الشائعة الاستخدام لتوليد بيانات التسلسل وكثيرا ً ما تتطلب تعديلات على البروتوكولات الراسخة. الأنسجة FFPE تمثل مثل هذا النوع عينة التي تم استخدامها على نطاق واسع للعينات السريرية1،,2،,3. في حين يحافظ الحفاظ على الأنسجة في الحفاظ على الأنسجة، فإن الأحماض النووية في أنسجة FFPE عادة ما تظهر مجموعة واسعة من الضرر والتدهور، مما يجعل من الصعب استرداد المعلومات الجينومية التي قد تؤدي إلى رؤى مهمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاضطرابات المختلفة.
غالبًا ما تكون بيانات التعبير الجيني الناتجة عن تسلسل الحمض النووي الريبي مفيدة في دراسة آليات المرض والمقاومة وتكمل تحليل طفرة الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي أكثر عرضة للتدهور ، مما يجعل من الصعب توليد بيانات دقيقة للتعبير الجيني من أنسجة FFPE. وعلاوة على ذلك، ونظراً لأن توافر التسلسل والقدرة على تحمل تكلفته على نطاق واسع حديثان نسبياً، فإن العينات القديمة كثيراً ما لا تخزن في ظروف لازمة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بعض القضايا لعينات FFPE تشمل تدهور الحمض النووي الريبي بسبب التضمين في البارافين، والتعديل الكيميائي من الحمض النووي الريبي مما يؤدي إلى تجزئة أو الانكسار إلى العمليات الأنزيمية المطلوبة لتسلسل، وفقدان ذيول بولي ألف، والحد من انطباق oligo-dT كدليل لtranscriptase العكسي4. وثمة تحد آخر هو مناولة/ تخزين عينات FFPE في ظل ظروف دون المستوى الأمثل، مما قد يؤدي إلى مزيد من التدهور من جزيئات اللابيل مثل الحمض النووي الريبي في الأنسجة5. وينطبق ذلك بصفة خاصة على العينات القديمة التي ربما تكون قد جُمعت في وقت لم يكن من المتوقع إجراء تحليل للبيانات الجينية من جانب تسلسل الحمض النووي الريبي للعينات. كل هذه تؤدي إلى انخفاض نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج ة المتاحة لتوليد بيانات تسلسل مفيدة. وقد ثنى انخفاض احتمال النجاح، إلى جانب ارتفاع تكلفة التسلسل، العديد من الباحثين عن محاولة توليد وتحليل بيانات التعبير الجيني من عينات FFPE مفيدة محتملة. وقد أظهرت بعض الدراسات في السنوات الأخيرة قابلية استخدام أنسجة FFPE لتحليل التعبير الجيني22،6،,7،,8،,9،وإن كان لعدد أقل و / أو عينات أكثر حداثة.
كدراسة جدوى، استخدمنا الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات أنسجة ورم FFPE من ثلاثة مستودعات الأنسجة المتبقية من المراقبة، وعلم الأوبئة، ونتائج النهاية (SEER) سجلات السرطان لتسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني10. تم تخزين أنسجة FFPE من الأورام الغدية السُحّمة عالية الجودة من الأورام الرضّية السُمية الرضّحة من 7-32 سنة في ظروف مختلفة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. لأنه في معظم الحالات تم تخزين هذه الكتل في مواقع مختلفة لسنوات دون توقع أي تحليل وراثي حساس في المستقبل ، لم يتم توخي الكثير من الحذر للحفاظ على الأحماض النووية. وهكذا، أظهرت معظم العينات الحمض النووي الريبي سيئة الجودة، مع نسبة كبيرة من العينات الملوثة بالبكتيريا. ومع ذلك، تمكنا من إجراء قياس كمي للجينات، وقياس اتساق واستمرارية التغطية الجينية، وإجراء تحليل ارتباط بيرسون بين النسخ البيولوجية لقياس قابلية التكاثر. استنادا إلى مجموعة من لوحة الجينات التوقيع الرئيسي، قارنا العينات في دراستنا مع بيانات أطلس الجينوم السرطان (TCGA) وأكد أن ما يقرب من 60٪ من العينات لديها ملامح التعبير الجيني مماثلة11. استناداً إلى العلاقة بين مختلف نتائج مراقبة الجودة وبيانات التعريف عينة، حددنا مقاييس مراقبة الجودة الرئيسية التي لها قيمة تنبؤية جيدة لتحديد العينات التي من المرجح أن تولد بيانات تسلسل قابلة للاستخدام11.
هنا نحن وصف المنهجية المستخدمة لتقييم جودة FFPE-RNA، وتوليد المكتبات تسلسل بدءا من عينات الحمض النووي الريبي المستخرج، وتحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات التسلسل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتوضح الطريقة الموصوفة هنا الخطوات الرئيسية المطلوبة للحصول على بيانات تسلسل جيدة من عينات FFPE-RNA. النقاط الرئيسية للنظر مع هذه الطريقة هي: (1) ضمان الحفاظ على الحمض النووي الريبي على أفضل وجه ممكن بعد الاستخراج عن طريق تقليل مناولة العينة وتجميدها وذوبان دوراتها. الaliquots مراقبة الجودة منفصل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للدكتورة دانييل كاريك (قسم مكافحة السرطان وعلوم السكان، المعهد الوطني للسرطان) للحصول على مساعدة مستمرة، وخاصة لبدء هذه الدراسة، وتزويدنا بالعينات، وللاقتراحات المفيدة أثناء تحليل البيانات. نشكر بإخلاص جميع أعضاء مرفق تسلسل CCR في مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان لمساعدتهم أثناء إعداد العينة وتسلسلها ، وخاصة بريندا هو للمساعدة في عينة QC ، أوكسانا الألمانية لمكتبة QC ، تاتيانا سميرنوفا لتشغيل المنظمين. كما نود أن نشكر تساي وي شين وآشلي والتون في مجموعة المعلوماتية الحيوية لمرفق التسلسل للمساعدة في تحليل البيانات وتنفيذ خط أنابيب RNA-seq. كما نشكر CCBR وNCBR على المساعدة في خط أنابيب تحليل RNaseq وأفضل الممارسات.
Materials
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
| Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
| Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
References
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).
- Hedegaard, J., et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).
- Esteve-Codina, A., et al. A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples. PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).
- Vukmirovic, M., et al. Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Sinicropi, D., et al. Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue. PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).
- Altekruse, S. F., et al. SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).
- Zhao, Y., et al. Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas. PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma. Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).
- Wimmer, I., et al. Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples. Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).
- . Babraham Bioinformatics Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2019)
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- . Babraham Bioinformatics Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/ (2019)
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
- Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data. BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).
- McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Mootha, V. K., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
- Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf (2016)
