水生生態系における微生物行動を調べるSitu chemotaxisアッセイで
Summary
ここで提示される、環境中の微生物行動の研究を直接可能にする最近開発されたマイクロ流体装置であるin situ chemotaxisアッセイのプロトコルです。
Abstract
運動性や動性(細胞が化学勾配に応答して動きを変える能力)などの微生物行動は、細菌および古細菌領域に広がっています。Chemotaxisは、異機種環境において、リソース獲得のメリットを大きく引き出すことができます。また、生物地球化学サイクリングなどの共生相互作用、疾患、グローバルプロセスにおいても重要な役割を果たしています。しかし、現在の技術は、研究を実験室に限定し、現場で容易に適用できるものではありません。ここで提示されるのは、自然環境で直接微生物の走気軸の強い調合を可能にする装置であるin situ chemotaxisアッセイ(ISCA)の展開のためのステップバイステップのプロトコルです。ISCAは、目的の化学物質をロードすることができる20の井戸アレイからなるマイクロ流体装置です。水性環境に展開すると、化学物質が井戸から拡散し、微生物が感知し、気胸を介して井戸に泳ぐことによって応答する濃度勾配を作成します。次に、(1)フローサイトメトリーを介して特定の化合物に対する化学戦術応答の強度をサンプリングし、定量化することができ、(2)分離および培養応答性微生物、および(3)分子技術を通じて応答集団の同一性およびゲノム電位を特徴付ける。ISCAは、海洋、淡水、土壌環境など、水性の段階を持つあらゆるシステムに導入できる柔軟なプラットフォームです。
Introduction
多様な微生物は運動性と走性を利用して、パッチ状の栄養環境を利用したり、宿主を見つけたり、有害な条件11、2、32,3を避けたりします。これらの微生物行動は、化学変換4の速度に影響を与え、陸上、淡水、海洋生態系22、5にわたる共生パートナーシップを促進する可能性がある。
Chemotaxisは、過去60年間の実験室条件下で広範囲に研究されてきた6.この化学式を研究する第1の定量法は、毛細管アッセイ、細菌6の懸濁液に浸漬した推定化学誘引剤で満たされた毛細管チューブを含む。チューブから化学物質の拡散は化学的勾配を作成し、化学戦術細菌は、チューブ7に移行することによって、この勾配に応答します。毛,細管アッセイの開発以来、現在でも広く使用されているが、他の多くの技術は、マイクロ流体8、9、109の使用を含む最新の、ますます制御された物理的/化学的条件下8での遠隔性度を研究するために開発されてきた。10
マイクロ流体は、高速ビデオ顕微鏡と共に、慎重に制御された勾配に応答して単一細胞の挙動を追跡することを可能にする。これらの技術は、我々の化学軸に対する理解を大幅に向上させましたが、実験室での使用に制限されており、環境システムにおける現場展開に容易に変換されません。その結果、細菌の自然界が自然生態系内で化学運動を使用する能力は調べられていない。したがって、化学体系の潜在的な生態学的重要性に関する現在の理解は、人工実験室の状態と限られた数の実験室で培養された細菌分離株に偏っている。最近開発された ISCA はこれらの制限を克服します11.
ISCAは毛細管アッセイの一般原則に基づいています。しかし、現代の微細加工技術を利用して、自然環境に関心のある化合物に向けて、走性を定量化するための高度に複製された容易に展開可能な実験プラットフォームを提供します。また、直接単離または分子技術による化学戦術微生物の同定と特性解析も可能です。最初の作業装置はガラスとPDMS11で自作され、構築されたが、最新の射出成形版はポリカーボネートで構成され、高度に標準化された製造手順を使用する(最新バージョンのデバイスに関心を持つため、対応する著者に連絡することができる)。
ISCAはクレジットカードサイズで、5 x 4ウェルアレイに分布する20個の井戸で構成され、それぞれが小さなポート(直径800μm)で外部水生環境にリンクされています。 図 1)。井戸に積み込まれた推定化学誘引物質は、ポートを介して環境に拡散し、化学戦術微生物は港を通って井戸に泳ぐことによって反応します。自然環境における ISCA 実験の結果に影響を与える要因が多くあるため、このステップバイ ステップ のプロトコルは、新しいユーザーが潜在的な障害を克服し、効果的な展開を促進するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
水生微生物の規模では、環境は均質から遠く離れており、多くの場合、微生物群集1、15,15を構成する物理的/化学的勾配によって特徴付けられる。また、行動を用いるための運動性微生物の能力(すなわち、走性)は、これらの異種微小環境1内での採餌を容易にする。環境中で直接走性を研究することは、重要な相互特異的相互作用?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ゴードンとベティムーア財団海洋微生物学イニシアチブによって、J.R.S.とR.S.にGBMF3801を付与することによって部分的に資金提供されました。 R.S.に対する調査官賞(GBMF3783)、オーストラリア研究評議会フェローシップ(DE160100636)、サイモンズ財団からB.S.L.(594111)への賞、サイモンズ財団(542395)からR.S.への助成金
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
Riferimenti
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