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Ambiente

Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61067
, ,
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas,Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology,Texas A&M University

Summary

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Abstract

El silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) es una herramienta rápida y eficiente para la caracterización funcional de microARN (miARN) en plantas. El sistema VbMS se ha desarrollado y aplicado para varias especies de plantas, incluyendo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodón y plantas monocotiledóneas como el trigo y el maíz. Aquí, describimos un protocolo detallado que utiliza vectores VbMS basados en PVX para silenciar los miRNAs endógenos en la papa. Para derribar la expresión de un miRNA específico, se diseñan moléculas mímicas (TM) objetivo de miRNA de interés, integradas en vectores de virus vegetales, y expresadas en papa por infiltración de Agrobacterium para unirse directamente al miRNA endógeno de interés y bloquear su función.

Introduction

Los microARN de las plantas (miRNAs) se caracterizan por ser ARN reguladores de 20 a 24 nucleótidos de longitud, codificados nuclearmente1 y desempeñan un papel fundamental en casi todos los aspectos de los procesos biológicos de las plantas, incluidos el crecimiento y el desarrollo2,3, la fotosíntesis y el metabolismo4,5,6,7, la síntesis y señalización hormonal8,9, las respuestas bióticas y abióticas10, 11,12,13, y regulación de nutrientes y energía14,15. Las funciones reguladoras de los miRNAs de las plantas están bien programadas y se cumplen típicamente a niveles post-transcripcionales mediante la escisión o la represión traslacional de los ARNm objetivo.

Se han logrado enormes avances hacia la identificación, el perfil transcripcional y la predicción de objetivos de miRNAs en papa16,17,18,19,20,21. Sin embargo, la caracterización funcional de los miRNAs en plantas, incluida la papa, se ha quedado atrás de otros organismos debido a la falta de enfoques genéticos eficientes y de alto rendimiento. Es difícil realizar análisis funcionales de miRNA individual mediante análisis estándar de pérdida de función, porque la mayoría de los miRNAs pertenecen a familias con redundancia genética considerable22. Además, un solo miRNA puede controlar múltiples genes diana23 y varios miRNAs diferentes pueden modular la misma vía molecular de forma colaborativa24,25. Estas propiedades dificultan la caracterización de la función de un miRNA específico o una familia de miRNA.

Gran parte del análisis funcional de los miRNAs se ha basado en gran medida en enfoques de ganancia de función que tienen limitaciones obvias. El método de miRNA artificial (amiRNA) explota las transcripciones primarias endógenas (pri-miRNAs) para producir miRNAs a un alto nivel, lo que lleva a la inhibición de la expresión génica diana26,27,28,29. Sin embargo, el etiquetado de activación y la sobreexpresión de miRNA utilizando un fuerte promotor constitutivo de 35S a menudo conducen a una mayor expresión de miRNAs que no son representativos de condiciones in vivo y, por lo tanto, pueden no reflejar la función endógena de miRNAs30. Se ha desarrollado un enfoque alternativo que involucra la expresión de formas resistentes a miRNA de genes diana que contienen mutaciones evitables en los sitios de unión y/o escisión31,32,33. Pero este enfoque también puede causar una mala interpretación del fenotipo derivado del transgén objetivo resistente al miRNA debido a artefactos transgénicos. Por lo tanto, las conclusiones de estos estudios de ganancia de función deben extraerse con precaución34. Otra limitación importante de los enfoques descritos anteriormente es que requieren transformación, que requiere mucha mano de obra y requiere mucho tiempo. Además, los enfoques dependientes de transgenes son difícilmente aplicables para las especies de plantas transformadas-recalcitrantes. Por lo tanto, es esencial desarrollar un enfoque rápido y eficiente de pérdida de función para desentrañar la función de los miRNAs.

Para eludir el requisito previo del procedimiento de transformación, se ha establecido el silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) mediante la combinación de las estrategias de imitación objetivo (TM) con vectores derivados de virus. En el sistema VbMS, las moléculas tm diseñadas artificialmente se expresan transitoriamente desde una columna vertebral del virus, ofreciendo una herramienta potente, de alto rendimiento y ahorro de tiempo para diseccionar la función de los miRNAs endógenos de las plantas35,36. VbMS se desarrolló inicialmente en N. benthamiana y tomate con el virus del sonajero del tabaco (TRV)35,36,37 y se ha extendido a Arabidopsis, algodón, trigo y maíz utilizando varios otros sistemas de expresión de virus, incluido el virus de la papa X (PVX)38, el virus de la arruga de la hoja de algodón (ClCrV)39, el virus del mosaico del pepino (CMV)40,41,42, el virus del mosaico del trigo chino (CWMV)43 , y el virus del mosaico de la raya de cebada (BSMV)44,45.

La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto cultivo alimentario más importante y el cultivo no aéreo más cultivado en el mundo, principalmente debido a su alto valor nutricional, alta producción de energía y requerimientos de insumos relativamente bajos46. Varias características de la papa la convierten en una atractiva planta modelo dicotiledónea. Es un cultivo poliploide propagado vegetativamente con alta tasa de cruce, heterocigosidad y diversidad genética. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún informe que caracterice la función de los miRNAs en papa utilizando VbMS. Aquí, presentamos un enfoque VbMS basado en VbMS basado en PVX de papa adaptado a la clonación independiente de la ligadura (LIC) para evaluar la función de los miRNAs en plantas de papa38. Seleccionamos la familia miR165/166 para ilustrar el ensayo VbMS porque la familia miR165/166 y sus ARNm objetivo y los factores de transcripción homeodominio/cremallera Leu clase III (HD-ZIP III) se han caracterizado ampliamente22,47,48. Los genes HD-ZIP III son reguladores clave del desarrollo del meristemo y la polaridad de los órganos, y la supresión de la función miR165/166 conduce a una mayor expresión de los genes HD-ZIP III, lo que resulta en defectos de desarrollo pleotrópicos como la reducción de la dominancia apical y los patrones aberrantes de polaridad de la hoja22,35,38,41 . Los fenotipos de desarrollo fácilmente puntuables correlacionados con el silenciamiento de miRNA165/166 permiten una evaluación precisa de la efectividad del ensayo VbMS basado en PVX.

En este estudio, demostramos que el sistema VbMS basado en PVX puede bloquear efectivamente la función de los miRNAs en la papa. Debido a que el sistema de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) basado en PVX se ha establecido en varias variedades de papa49,50,51,52, este enfoque VbMS basado en PVX probablemente se puede aplicar a una amplia gama de especies de papa diploide y tetraploide.

Protocol

1. Cultiva plantas de papa. Propagar plantas de papa in vitro en tubos de cultivo (25 x 150 mm) con medios Murashige y Skoog (MS) más vitamina de Gamborg (mezcla de sal basal de MS, vitamina de Gamborg, sacarosa de 30 g/L, 3,5 g/L de agar, pH = 5,7). Coloque los tubos en la sala de crecimiento por debajo de 20–22 °C, fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de luz y de intensidad de luz de 120 μmol/m2∙s1.NOTA: Los nuevos brotes y raíces normalmente se desarrollan en 1-2 semanas a partir…

Representative Results

La Figura 2 muestra las plantas de papa PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crecimiento ectópico de los tejidos de las hojas desde el lado abaxial de la lámina de la hoja a lo largo de las venas. También se han observado fenotipos más severos, como la formación de hojas en forma de trompeta. Por el contrario, no se observó ninguna anomalía fenotípica en las plantas de control de PVX. Estos resultados muestran que el sistema VbMS fue efectivo para suprimir la función endógena del miRNA e…

Discussion

Presentamos un sistema de silenciamiento de miRNA basado en PVX para caracterizar la función de los miRNAs endógenos en papa mediante la integración del diseño STTM en el vector PVX. El sistema VbMS demostró ser eficaz en el silenciamiento de miRNA165/166 en papa, una familia de miRNA altamente conservada en todas las especies de plantas.

El enfoque de MT se ha desarrollado para interferir con la expresión de miRNAs basado en un imitador artificial del objetivo de miRNA que está diseña…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Yule Liu de la Universidad de Tsinghua por proporcionar el vector PVX-LIC. Este trabajo fue apoyado por un fondo de puesta en marcha de Texas A&M AgriLife Research y el Proyecto Hatch TEX0-1-9675 del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA a JS.

Materials

100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter – 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S
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Potato Virus XMicroRNA SilencingVbMSVirus-based MicroRNA SilencingMiRNAFunctional CharacterizationShort Tandem Target MimicPVXLigation Independent Cloning
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).
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