P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Summary

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o^– células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

Abstract

La investigación fDrug para el tratamiento de infecciones pulmonares está progresando hacia modelos predictivos in vitro de alta complejidad. La presencia multifacética de bacterias en los modelos pulmonares puede volver a adaptar la disposición epitelial, mientras que las células inmunitarias coordinan una respuesta inflamatoria contra las bacterias en el microambiente. Si bien los modelos in vivo han sido la opción de probar nuevos antiinfecciosos en el contexto de la fibrosis quística, todavía no imitan con precisión las condiciones in vivo de tales enfermedades en los seres humanos y los resultados del tratamiento. Los modelos complejos in vitro de las vías respiratorias infectadas a base de células humanas (epiteliales bronquiales y macrófagos) y patógenos relevantes podrían cerrar esta brecha y facilitar la traducción de nuevos antiinfecciosos a la clínica. Para ello, se ha establecido un modelo de cultivo de co-cultivo de la línea celular epitelial epitelial de fibrosis quística humana CFBE41o^– y de los macrófagos derivados de monocitos THP-1, imitando una infección de la mucosa bronquial humana por P. aeruginosa en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este modelo se configura en siete días, y los siguientes parámetros se evalúan simultáneamente: integridad de la barrera epitelial, transmigración de macrófagos, supervivencia bacteriana e inflamación. El presente protocolo describe un sistema robusto y reproducible para evaluar la eficacia de los fármacos y las respuestas del huésped que podrían ser relevantes para descubrir nuevos antiinfecciosos y optimizar su entrega de aerosoles a los pulmones.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno relevante en la fibrosis quística (CF) que contribuye al deterioro del tejido pulmonar¹. La producción de polisacáridos, como el alginato y otros exopolísacáridos mucoides, coordina el progreso de la enfermedad, que conduce a la adherencia bacteriana tenaz, limita la entrega de antibióticos a las bacterias y protege las bacterias contra el sistema inmunitario huésped^2. La transición de P. aeruginosa de la etapa planctónica a la formación de biopelículas es un tema crítico en este contexto, facilitando también la aparición de tolerancia a antibióticos.

En el contexto de CF, el ratón se ha utilizado principalmente como modelo. Los ratones, sin embargo, no desarrollan espontáneamente esta enfermedad con la introducción de mutaciones DE CF³. La mayoría de los estudios de biopelícula bacteriana y susceptibilidad a fármacos se han realizado en superficies abióticas, como los platos Petri. Sin embargo, este enfoque no representa la complejidad in vivo. Por ejemplo, hay barreras biológicas importantes, incluidas las células inmunitarias, así como el epitelio mucoso. Aunque P. aeruginosa es bastante tóxico para las células epiteliales, algunos grupos han logrado co-cultivar un biofilm anterior de P. aeruginosa con células bronquiales humanas. Estas células se originaron en pacientes con fibrosis quística con mutación CFTR (CFBE41o^– células)⁴ y permitieron evaluar la eficacia de los antibióticos⁵ o evaluar la corrección de la proteína CFTR durante la infección⁶. Se demostró que este modelo mejora la previsibilidad de la eficacia de los fármacos, además de permitir la caracterización de problemas con fármacos que fracasaron en fases posteriores del desarrollo de fármacos⁷.

Sin embargo, en el pulmón, el epitelio muesca está expuesto al aire. Además, las células inmunitarias presentes en las vías respiratorias, como los macrófagos tisulares, desempeñan un papel esencial contra los patógenos o partículas inhalados^8. Los macrófagos migran a través de las diferentes capas celulares para alcanzar el lumen bronquial y combatir la infección. Además, los medicamentos inhalados también tienen que hacer frente a la presencia de moco como un elemento no celular adicional de la barrera pulmonar aire-sangre⁹. De hecho, se han desarrollado varios modelos tridimensionales complejos (3D) in vitro, con el objetivo de aumentar la relevancia in vivo. Los sistemas de co-cultivo no sólo aumentan la complejidad de los sistemas in vitro para el descubrimiento de fármacos, sino que también permiten estudiar las interacciones células celulares. Tal complejidad se ha abordado en estudios sobre la migración de macrófagos¹⁰, la liberación de péptidos antimicrobianos por neutrófilos¹¹, el papel de la mucosidad en la infección⁹, y la reacción de células epiteliales al daño excesivo¹². Sin embargo, todavía falta un modelo in vitro infectado por CF fiable que presenta la mutación genética en CF, que está expuesta al aire (aumento de la condición fisiológica), e integra las células inmunitarias.

Para cerrar esta brecha, describimos un protocolo para el co-cultivo humano estable en 3D de las vías respiratorias infectadas. El modelo está constituido por células epiteliales bronquiales y macrófagos humanos, infectados con P. aeruginosa y capaces de representar una barrera difusa e inmunológica. Con el objetivo de probar los antiinfecciosos a un rendimiento razonablemente alto, este co-cultivo se estableció en la membrana de filtro permeable de las plaquitas de pozos, utilizando dos líneas celulares humanas: CFBE41o^– y THP-1 monophages derivados de monocitos. Además, para estudiar finalmente la deposición de los antiinfecciosos aerosolizados¹³, el modelo se estableció en la interfaz aire-líquido (ALI) en lugar de en condiciones de cobertura líquida (LCC).

Como informamos aquí, este modelo permite evaluar no sólo la supervivencia bacteriana sobre un tratamiento antibiótico, sino también la citotoxicidad celular, la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos y las respuestas inflamatorias, que son parámetros esenciales para el desarrollo de fármacos.

Este protocolo combina dos tipos celulares relevantes para la terapia de inhalación de las vías respiratorias pulmonares: macrófagos y epitelio bronquial CF. Estas células se siembran en lados opuestos de inserciones de soporte permeables, lo que permite la exposición celular al aire (llamadas condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este co-cultivo de células huésped se infecta posteriormente con P. aeruginosa. Ambas líneas celulares del huésped son de origen humano: las células epiteliales representan el epitelio bronquial de fibrosis quística, con una mutación en el canal CF (CFBE41o^–), y las células THP-1¹⁴ son una línea celular bien caracterizada similar a un macrófago. Primero se permite que una capa epitelial confluente se forme en la parte superior de las inserciones de placas de pozo antes de que las células similares a los macrófagos se añadan al compartimiento opuesto. Una vez establecida la cocultura en ALI, el sistema se inocula con P. aeruginosa en el lado apical. Este sistema de co-cultivo infectado se utiliza entonces para evaluar la eficacia de un antibiótico, por ejemplo, tobramicina. Se analizan los siguientes puntos finales: integridad de la barrera epitelial en términos de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), visualización de interacciones células celulares y células-bacterias mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), supervivencia bacteriana mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (CFU), supervivencia de células huésped (citotoxicidad) y liberación de citoquinas.

Protocol

1. Crecimiento y diferenciación de células en plaquitas de soporte permeable Cultivar CFBE41o- en un matraz T75 con 13 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales y 600 mg/L de glucosa a 37oC con una atmósfera de 5 % de CO2. Agregue un medio fresco a las células cada 2-3 días. Separar las células después de alcanzar el 70% de confluencia en el matraz con 3 ml de ácido etilenocrifaminatetraacético (ED…

Representative Results

La Figura 1A muestra la morfología del coculo resultante de células epiteliales bronquiales humanas y macrófagos después de crecer durante 24 h en el lado apical y basolateral de los soportes permeables, respectivamente. La integridad de la barrera epitelial se muestra con UNER más alto (834 x cm 2 ) y CLSMmediantela inmunostaining para la proteína de unión estrecha ZO-1(Figura 1B). Los mismos resultados observados en términos de integridad de…

Discussion

Este artículo describe un protocolo para un cocultivo 3D de las vías respiratorias infectadas, constituido por la línea celular epitelial epitelial de fibrosis quística humana CFBE41o- y la línea celular de macrófagos derivados de monocitos humanos THP-1. El protocolo permite evaluar la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos, la supervivencia de las bacterias y la inflamación, que son parámetros importantes al probar simultáneamente la eficacia de los fármacos y las respuestas del…

Materials

Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	–
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o– cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754