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Biochimica

天然物の生物調節特性を測定するプラナリアン運動性アッセイ

Published: May 30, 2020
doi:
10.3791/61070
, , , , , , ,
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Summary

プラナリアン運動は、湧水単独で動物の動きと比較した場合の天然物の覚醒剤および離脱特性を測定するために使用されます。

Abstract

非寄生プラナリアンを使用する簡単で制御可能な手段、 ドゥゲシアティグリナ、自由に生きている水生扁平虫は、天然物の覚醒剤および離脱特性を研究するために記述されている。プラナリアン生理学のユニークな側面から恩恵を受ける実験的アッセイは、創傷治癒、再生、および腫瘍形成に関する研究に適用されてきた。また、プラナリアンは様々な環境刺激に対する感受性を示し、条件付き応答を学習・開発することができるため、学習や記憶を調べる行動研究にも利用できます。プラナリアンは、基本的な二国間対称性と神経伝達物質システムを使用する中枢神経系を有し、神経筋バイオモジュレーターの効果を調べる研究に適している。その結果、物質中毒や撤退を調べるために、プラナリアンの動きや運動性を監視する実験システムが開発されました。プラナリアン運動は、刺激の影響を監視する敏感で簡単に標準化された運動アッセイシステムの可能性を提供するため、プラナリアン運動速度(pLmV)試験は、時間とともに動物が交差するグリッド線の数を決定することによって、プラナリアンによる刺激と撤退の両方の行動を監視するように適応されました。ここでは、技法とその応用を示し、説明します。

Introduction

記載されたプロトコルは、自然物質の生体調節効果を評価する手段を提供するためにプラナリアン運動性を使用しています。これらの物質が覚醒剤として機能するかどうか、そしてそれらが測定可能な離脱行動1に関連していたかどうかを判断するために具体的に適応された。このアッセイは、プラナリアン・ロコモーター速度(pLmV)試験として知られており、まず、既知の薬理学的薬剤22,3を試験するために用いられた。このプラナリアン運動性に基づくアッセイの適用は、その後人気が高まり、天然物以外の物質に興味を持つ異なる研究所で採用されています4,5.このアッセイのために、プラナリアンは、溶解したバイオモジュレーターを含む湧水または湧水を含むペトリ皿に置かれる。皿自体はグラフ紙に載せているので、容器のまわりに動物が交差するグリッド線の数は、各条件の移動速度を決定するために使用することができる。ライト/ダークテストは、条件付き場所優先試験(CPP)と呼ばれる、平面運動性を監視するテーマの別のバリエーションであり、動物が暗い環境にどれだけ速く反応し、暗くなった環境に移行するかを評価する66,7。7プラナリアンの動きのビデオ追跡は、コンピュータプログラムと質量の中心(COM)追跡898、9、10、1110,11を使用して分析することもできます。,

このような研究のための動物モデルとしてプラナリアンを使用すると、実験者が簡単にアッセイ環境を制御することができるという点で、他の動物よりもいくつかの利点を提供しています。具体的には、実験前にプラナリアンを飢えさせることで、結果を混乱させる可能性のある他の栄養学的または薬理学的薬剤への暴露を防ぐことができ、調査中の特定のバイオモジュレーターは、培養水に直接添加するだけでプラナリアンに導入され、それによって暴露を標準化することができる。プラナリアンは「高次」動物を連想させる神経系および神経伝達物質を有するため、これらの動物の神経筋刺激に対する生理学的および実験的反応は、他の生物12、13、14、15、16に生物学的に関連すると考えられている。12,13,14,15,16また、プラナリアンは比較的安価で実験室での維持が簡単であるため、多くの研究者にアクセス可能な生物学的モデルを提供します。

実験動物として、プラナリアンは幅広い研究に適している。例えば、我々のグループは、他の研究者と同様に、プラナリアンを使用して、腫瘍形成17、18、1918,19を研究する。17また、プラナリアンは、化学、熱、重力、電気、写真、磁気刺激など、他のアッセイシステムの基礎を形成する多くの応答挙動を示しています。これらの効果のいくつかは、これらの動物の学習と記憶を研究するために使用されています20, 21,,22,,2123,,24,,25,26, 27.,27現在の文献におけるプラナリアンモデルの主な使用は、ネオブラストと呼ばれるプラナリアン多能性幹細胞の活性と、再生28、29、3029,30におけるそれらの役割に焦点を当てている。28したがって、ここで説明するモデルを採用することで、他のプラナリアンベースのアッセイを使用して、天然物やその他のバイオモジュレーターが生物にどのような影響を与えるかをより広く理解することができます。

Protocol

1. プラナリアンの夫 必要に応じて、生物学的供給会社から購入したプラナリアンや野生捕獲を使用します。このプロトコルで使用されるプラナリアンは、供給リストに記載されているドゥゲシア・ティグリナです。この種はジラルディア・ティグリナ31とも呼ばれる。他の水生プラナリアン種も22,3を3受け入?…

Representative Results

実験を開始する前に、pLmVアッセイを実行するためのワークスペースの設置と準備を行う必要があります。これには、習慣化容器の調製、必要に応じて容器のすき取り(離脱実験用)、層皿を積層グリッド紙、および適切に配置されたカメラを含む(図1)。すべてのビデオを撮影したら、共通のデータシートを使用して、調査員間のデータ収集とプレゼンテーションを標準化?…

Discussion

天然物の覚醒剤と離脱効果を決定するために、簡単でアクセス可能なプラナリアン運動アッセイが記載されています。行動モデルとして、異なる実験者間で観測を標準化するために、動きを採点するための厳格なプロトコルと、あらゆる行動の明確な定義が必要です。提示されたアイデアは、これを達成する方法のデモンストレーションを提供します。このプロトコルを使用する各研究室は?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、この研究を支援するための出版助成金のための制度的進歩のオフィスとモリスビル大学財団、およびSUNYモリスビル大学の学部研究の継続的な支援と支援のためのSUNYモリスビル大学科学技術エントリープログラム(CSTEP)を認めたいと考えています。また、ソフィア・ハッチェンスに関する有益なコメントに感謝したいと思います。

Materials

Bottled Water – 1 Gal. Poland Spring N/A Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina) Carolina Biological Supply Company 132954 Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush Royal Crafter's Choice 9159 Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish – 10 cm Kimax N/A 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish – 5 cm Kimax N/A 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper Any N/A Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software) iPEVO https://www.ipevo.com/software/visualizer Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring Any N/A Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg Any N/A Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL Beckman N/A Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container – 10 cm Ziploc N/A 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush LOEW-Cornell N/A Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft
Transfer Pipette Any N/A Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera iPEVO CDVU-06IP Document camera (or other camera or cell phone camera)
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Riferimenti

  1. Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
  2. Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
  3. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  4. Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
  5. Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
  6. Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. , 8-13 (2013).
  7. Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
  8. Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
  9. Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
  10. Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
  11. Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
  12. Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
  13. Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
  15. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscienze. 153 (4), 1103-1114 (2008).
  16. Raffa, R. B., Rawls, S. M. . A model for drug action and abuse. , (2008).
  17. Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
  18. Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
  19. Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
  20. Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
  21. Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
  22. Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
  23. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
  24. Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
  25. de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
  26. Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
  27. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
  28. Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
  29. Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
  30. Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
  31. Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
  32. Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
  33. Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
  34. Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
  35. Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
  36. Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
  37. Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
  38. Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
  39. Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
  40. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
  41. Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
  42. Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a ‘bath salt’ cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
  43. Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).

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Voura, E. B., Pulquerio, C. H., Fong, R. A. M. V., Imani, Z., Rojas, P. J., Pratt, A. M., Shantel, N. M., Livengood, E. J. A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products. J. Vis. Exp. (159), e61070, doi:10.3791/61070 (2020).
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