En Planarian Motility Assay att mäta biomodulerande egenskaper naturliga produkter
Summary
Planarian motility används för att mäta de stimulerande och tillbakadragande egenskaper naturliga produkter när jämfört med förflyttning av djuren i källvatten ensam.
Abstract
En enkel, kontrollerbar medel för att använda den icke-parasitiska planarian, Dugesia tigrina, en frilevande vattenlevande vattenlevande flatworm, att studera stimulerande och tillbakadragande egenskaper naturliga produkter beskrivs. Experimentella analyser benefitting från unika aspekter av planarian fysiologi har tillämpats på studier om sårläkning, regenerering och tumorigenesis. Dessutom, eftersom planarians uppvisar känslighet för en mängd olika miljö stimuli och är kapabla att lära och utveckla betingade svar, de kan användas i beteendestudier undersöker lärande och minne. Planarianer besitter en grundläggande bilateral symmetri och ett centralt nervsystem som använder signalsubstanssystem mottagliga för studier som undersöker effekterna av neuromuskulära biomodulatorer. Följaktligen har experimentella system övervakning planarisk rörelse och motilitet har utvecklats för att undersöka substansberoende och tillbakadragande. Eftersom planarian motility erbjuder potential för en känslig, lätt standardiserad motility assay system för att övervaka effekten av stimuli, den planarian locomotor hastighet (pLmV) testet anpassades för att övervaka både stimulering och tillbakadragande beteenden av planarianer genom fastställandet av antalet rutnät linjer korsas av djuren med tiden. Här demonstreras och förklaras tekniken och dess tillämpning.
Introduction
Det protokoll som beskrivs använder planarisk motilitet för att tillhandahålla ett sätt att bedöma de biomodulerande effekterna av naturliga ämnen. Det var särskilt anpassat för att avgöra om dessa ämnen fungerar som stimulantia, och om de sedan var förknippade med en mätbar tillbakadragande beteende1. Denna analys, känd som den planarian locomotor hastighet (pLmV) test, användes först för att testa kända farmakologiska medel2,3. Tillämpningen av denna plana järmalhetsbaserade analys har sedan dess vuxit i popularitet och har antagits av olika laboratorier som är intresserade av andra ämnen än naturligaprodukter 4,5. För denna analys placeras en planarian i en petriskål som innehåller källvatten eller källvatten som innehåller en upplöst biomodulator. Eftersom själva skålen placeras på rutpapper, kan antalet rutnätslinjer som korsas av djuret med tiden när den rör sig om behållaren användas för att bestämma rörelsehastigheten i varje villkor. Ljus/mörker-testet, annars kallat CPP (conditioned place preference test), är en annan variant på temat övervakningsplanarisk motilitet, och bedömer hur snabbt djuren svarar och migrerar till en förmörkar miljö6,7. Video spårning av planarisk rörelser kan också analyseras med hjälp av datorprogram och centrum för massa (COM) spårning8,9,10,11.
Att använda planarianen som en djurmodell för sådana studier erbjuder flera fördelar jämfört med andra djur genom att försökssävlaren lätt kan kontrollera analysen miljön. Närmare bestämt svälter planarianerna innan experiment kan förhindra deras exponering för andra näringsmässiga eller farmakologiska medel som annars kan förvirra resultaten, och den specifika biomodulatorn under utredning kan införas till planatörerna helt enkelt genom att lägga till det direkt till kulturvattnet, vilket standardiserar exponeringen. Eftersom planarianer har ett nervsystem och signalsubstanser som påminner om ‘högre ordningsdjur’ anses dessa djurs fysiologi och experimentella svar på neuromuskulära stimuli vara biologiskt relevanta för andra organismer12,13,14,15,16. Dessutom, eftersom planarianer är relativt billiga och okomplicerade att underhålla i laboratoriet, erbjuder de en tillgänglig biologisk modell för många utredare.
Som försöksdjur är planarianer lämpliga för ett brett spektrum av studier. Till exempel, vår grupp, liksom andra utredare använder planarianer för att studera tumorigenesis17,18,19. Planarianer uppvisar också en mängd svarsbeteenden på kemiska, termiska, gravitationella, elektriska, foto och magnetiska stimuli som har legat till grund för andra analyssystem. Några av dessa effekter har använts för att studera inlärning och minne hosdessa djur 20,21,22,23,24,25,26,27. Den primära användningen av den plana modellen i litteraturen för närvarande fokuserar på verksamheten i planarian pluripotenta stamceller, kallas neoblaster, och deras roll i regenerering28,29,30. Således, anta den modell som beskrivs här möjliggör ytterligare studier med hjälp av andra planarian-baserade analyser för att ge en bredare förståelse för hur naturliga produkter och andra biomodulatorer påverkar organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
En okomplicerad och tillgänglig planarian motility assay beskrivs för att bestämma stimulerande och abstinenseffekter av naturliga produkter. Som beteendemodell är det nödvändigt att ha stränga protokoll för poängsättning rörelse och tydliga definitioner av eventuella beteenden för att standardisera observationer mellan olika experimentörer. De framlagda idéerna erbjuder en demonstration av hur detta kan uppnås. Varje laboratorium som använder detta protokoll bör anpassa den presenterade informationen s?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna kontoret för institutionella Advancement, och Morrisville College Foundation för en publikation bidrag för att stödja detta arbete, liksom SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) för deras pågående stöd och stöd till grundutbildningen forskning vid SUNY Morrisville. Vi vill också tacka Sophia Hutchens för hjälpsamma kommentarer om den teknik som beskrivs.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
Riferimenti
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. , 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscienze. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. . A model for drug action and abuse. , (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a ‘bath salt’ cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
