Isolasjon, transfection, og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter

Summary

Her presenterer vi en protokoll for isolasjon, transfection og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter.

Abstract

Ex vivo kultur av voksne pattedyr kardiomyocytter (CMs) presenterer det mest relevante eksperimentelle systemet for in vitro studiet av hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differensierte celler med minimal proliferativ kapasitet. Den post-mitotiske tilstanden til voksne CMs begrenser ikke bare kardiomyocyte celle syklus progresjon, men begrenser også den effektive kulturen av CMs. Videre er den langsiktige kulturen i voksne CMs nødvendig for mange studier, for eksempel CM spredning og analyse av genuttrykk.

Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyrene som skal brukes til kardiomyocyteisolering. Mens den langsiktige kulturen av rotte CMs er mulig, er voksne mus CMs utsatt for døden og kan ikke dyrkes mer enn fem dager under normale forhold. Derfor er det et kritisk behov for å optimalisere celleisolasjonen og den langsiktige kulturprotokollen for voksne murine CMs. Med denne modifiserte protokollen er det mulig å isolere og kultur både voksne mus- og rotte-CMs i mer enn 20 dager. Videre er siRNA transfection effektiviteten av isolert CM betydelig økt sammenlignet med tidligere rapporter. For voksen mus CM isolasjon benyttes Langendorff perfusjonsmetoden med en optimal enzymløsning og tilstrekkelig tid for fullstendig ekstracellulær matrisedissosiasjon. For å oppnå rene ventrikulære CMs, ble begge atria dissekert og forkastet før de fortsatte med disassociation og plating. Cellene ble spredt på en lamininbelagt plate, noe som tillot effektiv og rask feste. CMs fikk lov til å bosette seg for 4-6 h før siRNA transfection. Kulturmedier ble oppdatert hver 24 timer i 20 dager, og deretter ble CMs fikset og farget for hjertespesifikke markører som Troponin og markører for cellesyklus som KI67.

Introduction

Hjertesykdommer er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Nesten alle typer hjerteskader resulterer i et betydelig tap av voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyrhjerter er ikke i stand til å reparere hjerteskaden på grunn av den senescent naturen til den voksne CM¹. Dermed resulterer enhver fornærmelse mot det voksne pattedyrhjertet i et permanent tap av CMs, noe som fører til redusert hjertefunksjon og hjertesvikt. I motsetning til voksne pattedyr, kan små dyr som sebrafisk og newt hjerter regenerere hjerteskaden gjennom eksisterende CM-spredning^2,,3,,4. En verdensomspennende innsats pågår for å finne en ny terapeutisk intervensjon for hjerteskade via både proliferative og ikke-proliferative tilnærminger. I de siste tiårene har ulike typer genetiske musemodeller blitt utviklet for å studere hjerteskade og reparasjon. Men ved hjelp av in vivo dyremodeller fortsetter å være en dyr tilnærming med den ekstra kompleksiteten for å tyde en celle-autonom mekanisme fra sekundære effekter. Dessuten er in vivo-systemer utfordrende å analysere CM-spesifikke effekter av en farmakologisk intervensjon som induserer kardiobeskyttende signalering fra CM.

Videre er den langsiktige kulturen av voksne CMs nødvendig for å utføre CM spredningsanalyser. CM spredningsanalyser krever minst 4-5 dager for celler som skal induseres i cellesyklusen og for å få nøyaktige data etter det. I tillegg er studier som benytter isolerte CMs for elektrofysiologiske studier, legemiddelscreening, toksisitetsstudier og Ca⁺⁺ homeostasestudier alle behov for et forbedret kultursystem^5,,6,,7. Videre viser nyere studier kardiobeskyttende betydning av cytokiner utskilles fra CMs (cardiokines)^8,9. For å undersøke den terapeutiske rollen og molekylære mekanismen til disse kardiokinene under hjertereparasjon og regenerering, er det nødvendig med en langvarig kultur.

Voksen rotte CMs er robust nok for encellede isolasjon og langsiktig kultur i et in vitro system^10,11,12. Imidlertid er voksne mus CMs av stor interesse for in vitro-analyser, på grunn av tilgjengeligheten av en rekke genmodifiserte musemodeller, noe som gjør det mulig å designe og utføre ulike innovative analyser som ikke er mulige med rotte CM¹³. I motsetning til voksen rotte CM isolasjon, er det ganske utfordrende å få en encellede suspensjon fra voksne musehjerter, og den langsiktige kulturen av voksne mus CMs i kultur er enda mer utfordrende.

Voksen CM isolasjon fra mus og rotte hjerter ved hjelp av en Langendorff system har tidligere blitt etablert for å studere CM^{funksjon 5,14,15}. Her har vi beskrevet i detalj protokollene for voksen CM-isolasjon fra både rotter og mus, samt en modifisert langsiktig kultur, transinfeksjon og CM-spredning av isolerte celler.

Protocol

Alle eksperimenter bør utføres i samsvar med retningslinjene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr publisert av U.S. National Institute of Health (NIH). Alle protokollene som vises i videoen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Cincinnati, College of Medicine. 1. Forberedelse før hjerteutvinning fra voksne mus (og rotter) Forbered den tilsvarende perfusjonen, enzymet og stoppløsningene, i henhold til oppskriftene gitt…

Representative Results

Den nåværende modifiserte protokollen muliggjør effektiv isolasjon og kultur av rotte og mus CMs in vitro. For rotte CM isolasjon ble totalt 3 voksne (12 uker gamle) hann Fischer 344 rotter brukt i prosedyren. Figur 1 viser kirurgisk apparat og isolasjonsoppsett som kreves i prosedyren; hver del er merket og beskrevet i figurlegenden. Kollagnase type 2 ble brukt til fordøyelsen, noe som gir en høy mengde høykvalitets CMs fra vellykket isolasjon (Figur 2A)….

Discussion

Det er et kritisk behov for å etablere en protokoll for voksen kardiomyocyte isolasjon og langsiktig kultur for å utføre cellespesifikke mekanistiske studier. Det er bare noen få rapporter som diskuterer voksne CM isolasjonsprotokoller, og enda færre av dem brukes til langsiktig kultur av voksne mus CM^15,16,17. Det er vist at den voksne rotte CM har en høyere toleranse for in vitro kultur enn de voksne musene CM<sup class=…

Materials

2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S