İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü
Summary
Burada, yetişkin fare ve sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültürü için bir protokol sıyoruz.
Abstract
Erişkin memeli kardiyomiyositlerin (CMs) ex vivo kültürü, kardiyak biyolojinin in vitro çalışması için en uygun deneysel sistemi sunmaktadır. Erişkin memeli CM’ler en az proliferatif kapasiteye sahip ölümcül farklılaşmış hücrelerdir. Erişkin CM’lerin mitotik sonrası durumu sadece kardiyomiyosit hücre döngüsünün ilerlemesini kısıtlamakla kalmamış, aynı zamanda CM’lerin verimli kültürünü de sınırlandırır. Ayrıca, yetişkin CM’lerin uzun vadeli kültürü CM proliferasyonu ve gen ekspresyonunun analizi gibi birçok çalışma için gereklidir.
Fare ve sıçan kardiyomiyosit izolasyonu için kullanılan iki en çok tercih edilen laboratuvar hayvanlarıdır. Sıçan CM’lerinin uzun süreli kültürü mümkün olsa da, yetişkin fare CM’leri ölüme duyarlıdır ve normal koşullarda beş günden fazla kültürlenemez. Bu nedenle, yetişkin murine CMs için hücre izolasyonu ve uzun vadeli kültür protokolü optimize etmek için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu değiştirilmiş protokol ile, 20 günden fazla hem yetişkin fare yi hem de fare CM’lerini başarılı bir şekilde izole etmek ve kültüretmek mümkündür. Ayrıca, izole CM siRNA transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde önceki raporlara göre artmıştır. Yetişkin fare CM izolasyonu için Langendorff perfüzyon yöntemi optimal enzim çözeltisi ve tam ekstrasellüler matriks ayrışması için yeterli zaman ile kullanılmaktadır. Saf ventriküler CM’ler elde etmek için, her iki atria diseksiyon ve kaplama ile devam etmeden önce diseksiyon ve atılır. Hücreler verimli ve hızlı bağlanmaya olanak sağlayan laminin kaplı bir plaka üzerinde dağıtıldı. CMs siRNA transfeksiyon önce 4-6 saat yerleşmek için izin verildi. Kültür medyası 20 gün boyunca her 24 saatte bir yenilendi ve daha sonra, CM’ler Troponin ve KI67 gibi hücre döngüsünün belirteçleri gibi kardiyak spesifik belirteçler için sabit lendi ve lekelendi.
Introduction
Kalp hastalıkları dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Kardiyak yaralanmanın hemen hemen her türü erişkin kardiyomiyosit (CM) kaybıile sonuçlanır. Erişkin memeli kalpler yetişkin CM1senescent doğası nedeniyle kardiyak yaralanma onarmak mümkün değildir. Böylece, yetişkin memeli kalp herhangi bir hakaret CMs kalıcı bir kaybına yol, azaltılmış kalp fonksiyonu ve kalp yetmezliğine yol açan. Yetişkin memelilerin aksine, zebra balığı ve yeni kalpler gibi küçük hayvanlar mevcut CM çoğalması2,3,4ile kardiyak yaralanmalarını yenileyebilirler. Hem proliferatif hem de proliferatif olmayan yaklaşımlar la kardiyak yaralanmalar için yeni bir terapötik müdahale bulmak için dünya çapında bir çaba devam etmektedir. Son yıllarda, genetik fare modelleri çeşitli kardiyak yaralanma ve onarım çalışma geliştirilmiştir. Ancak, in vivo hayvan modelleri kullanarak ikincil etkileri bir hücre özerk mekanizma deşifre etmek için ek karmaşıklığı ile pahalı bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ayrıca in vivo sistemleri, CM’den kardiyoprotektif sinyalizasyona neden olan farmakolojik bir müdahalenin CM’ye özgü etkilerini analiz etmek zordur.
Ayrıca, cm proliferasyon analizleri yapmak için yetişkin CM’lerin uzun vadeli kültürü gereklidir. CM proliferasyon tahlilleri hücrelerin hücre döngüsüne indüklenen ve bundan sonra doğru veri elde etmek için en az 4-5 gün gerektirir. Ayrıca, elektrofizyolojik çalışmalar, ilaç taraması, toksisite çalışmaları ve Ca++ homeostaz çalışmaları için izole CM’ler kullanan çalışmalar tüm gelişmiş bir kültür sistemi 5 ihtiyacı vardır5,6,7. Ayrıca, son çalışmalar CMs salgılanan sitokinlerin kardiyoprotektif önemini göstermektedir (kardiyokines)8,9. Kalp onarımı ve rejenerasyonu sırasında bu kardiyokinelerin terapötik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için uzun süreli bir kültür gereklidir.
Yetişkin sıçan CMs bir in vitro sistem10,,11,,12tek hücreli izolasyon ve uzun vadeli kültür için yeterince sağlam . Ancak, yetişkin fare CMs in vitro tahliller için büyük ilgi vardır, genetik olarak değiştirilmiş fare modelleri çeşitli durumu nedeniyle, hangi tasarım ve sıçan CM ile mümkün değildir çeşitli yenilikçi analizlerin yürütülmesi için izin verir13. Yetişkin fare CM izolasyon aksine, yetişkin fare kalplerden tek hücreli süspansiyon elde etmek oldukça zordur, ve kültür yetişkin fare CMs uzun vadeli kültür daha da zordur.
Bir Langendorff sistemi kullanarak fare ve sıçan kalplerinden Yetişkin CM izolasyon u daha önce CM fonksiyonu5,14,,15çalışma kurulmuştur. Burada, hem sıçanlardan hem de farelerden yetişkin CM izolasyonprotokollerinin yanı sıra izole edilmiş hücrelerin değiştirilmiş uzun vadeli kültürü, transfeksiyonu ve CM çoğalmasını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücreye özgü mekanistik çalışmalar yapabilmek için yetişkin kardiyomiyosit izolasyonu ve uzun vadeli kültür için bir protokol kurulması çok önemlidir. Yetişkin CM izolasyon protokolleri tartışırken sadece birkaç rapor vardır, ve hatta bunların daha az yetişkin farelerCM15,,16,,17uzun vadeli kültür için kullanılır. Bu yetişkin sıçan CM yetişkin fareler CM10,<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Cincinnati Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü’nden Dr. Onur Kanisicak’a; Dr. Onur Kanisicak’a Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (R01HL148598) hibe. Dr. Onur Kanisicak, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü (18CDA34110117) tarafından desteklenmiştir. Dr. Perwez Alam, Amerikan Kalp Birliği doktora sonrası hibe (AHA_20POST35200267) tarafından desteklenir. Dr Malina J. Ivey bir NIH T32 hibe (HL 125204-06A1) tarafından desteklenir.
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Riferimenti
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
