En Lab-On-A-Chip platform til stimulering af Osteocyte Mechanotransduction og analyse af funktionelle resultater af Bone Remodeling
Summary
Her præsenterer vi protokoller til analyse af knoglerremodellering i en lab-on-a-chip platform. En 3D-printet mekanisk belastningsenhed kan parres med platformen for at fremkalde osteocyte mechanostransduktion ved at deformere den cellulære matrix. Platformen kan også bruges til at kvantificere knogleremodelleringsfunktionelle resultater fra osteoklaster og osteoblaster (resorption/dannelse).
Abstract
Bone remodeling er en stramt reguleret proces, der er nødvendig for skeletvækst og reparation samt tilpasning til ændringer i det mekaniske miljø. Under denne proces, mechanosensitive osteocytter regulere de modsatrettede reaktioner mellem katabolske osteoklaster og anabolske osteoblaster. For bedre at forstå de meget indviklede signalveje, der regulerer denne proces, har vores laboratorium udviklet en grundlæggende lab-on-a-chip (LOC) platform til analyse af funktionelle resultater (dannelse og resorption) af knogleremodellering inden for et lille system. Som knogle remodeling er en langvarig proces, der opstår i størrelsesordenen uger til måneder, vi udviklede langsigtede celle dyrkning protokoller i systemet. Osteoblaster og osteoklaster blev dyrket på funktionelle aktivitetssubstrater i LOC og opretholdt i op til syv uger. Derefter blev chips skilt ad for at muliggøre kvantificering af knogledannelse og resorption. Derudover har vi designet en 3D-printet mekanisk lasteenhed, der parrer med LOC-platformen og kan bruges til at fremkalde osteocyte mechanotransduktion ved at deformere cellulære matrix. Vi har optimeret celledyrkningsprotokoller for osteocytter, osteoblaster og osteoklaster i LOC-platformen og har behandlet problemer med sterilitet og cytotoksicitet. Her præsenterer vi protokollerne til fremstilling og sterilisering af LOC, såning celler på funktionelle substrater, inducerende mekanisk belastning, og demontering loc at kvantificere slutpunkt resultater. Vi mener, at disse teknikker lægger grunden til at udvikle en sand orgel-on-a-chip til knogleremodellering.
Introduction
Bone er en meget dynamisk væv, der kræver indviklet koordinering blandt de tre store celletyper: osteocytter, osteoblaster, og osteoklaster. Flercellulære interaktioner mellem disse celler er ansvarlige for knogletab, der opstår under lammelse og langvarig ubevægelighed og for knogledannelse, der opstår som reaktion på vækst og motion. Osteocytter, den mest rigelige knoglecelletype, er meget følsomme over for mekaniske stimuli anvendes på knoglen. Mekanisk stimulation ændrer osteocyt metabolisk aktivitet og fører til en stigning i centrale signalering molekyler1,2. Gennem denne proces, kendt som mechanotransduktion, osteocytter kan direkte koordinere aktiviteterne i osteoblaster (knogledannende celler) og osteoklaster (knogle resorbing celler). Vedligeholdelse knogle homøostase kræver en stram regulering mellem knogledannelse og knogle resorption satser; men, forstyrrelser i denne proces kan resultere i sygdomstilstande såsom osteoporose eller osteopetrose.
Kompleksiteten af interaktioner mellem disse tre celletyper egner sig godt til undersøgelse udnytte mikrofluidiske og lab-on-a-chip (LOC) teknologier. Med henblik herpå har vores laboratorium for nylig etableret proof of concept af en LOC platform til analyse af knogleresorption og dannelse (funktionelle resultater) i knoglen remodeling processen. Platformen kan bruges til undersøgelse af cellulære interaktioner, ændrede lastning miljøer, og investigational drug screening. I de seneste år er forskellige mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at undersøge de molekylære signalveje, der regulerer knogleremodellering; Mange af disse systemer kvantificerer imidlertid ommodelleringen ved hjælp af indirekte markører , der er tegn på funktionel aktivitet3,4,5,6,7. En fordel ved vores system er, at det kan bruges til direkte kvantificering af funktionelle resultater. Knogleremodellering er en langsigtet proces. Som sådan kræver direkte kvantificering af knoglersorption og dannelse et dyrkningssystem , der kan opretholdes i mindst flere uger til månederne 8,9,10,11. Således, når udviklingen af LOC platform, vi etableret langsigtede dyrkning protokoller er nødvendige for dannelse og resorption og har opretholdt celler i systemet i op til syv uger11. Derudover har vi indarbejdet passende dyrkningssubstrater for begge celletyper i platformen; osteoklaster blev dyrket direkte på knoglen, og osteoblaster, som er kendt for at være plastik klæbende, blev dyrket på polystyren diske. Endvidere har vi behandlet spørgsmål vedrørende sterilitet, langsigtet cytotoksicitet og spåndeenhed til remodeling analyse11,12.
LOC-platformen kan også bruges til at fremkalde osteocyt mechanotransduktion gennem matrixdeformation. En 3D trykt mekanisk lastning enhed blev udviklet til at parre med LOC og anvende en statisk ud af flyet udaf flyet udistention at strække cellerne13. For at imødekomme denne mekaniske belastning blev dybden af brønden i LOC øget. Denne lille skala, enkel mekanisk lastning enhed kan nemt produceres af laboratorier med begrænset teknisk erfaring, og vi har tidligere delt tegninger af 3D trykte komponenter13. I det nuværende arbejde demonstrerer vi nogle af de nye teknikker, der er nødvendige for en vellykket brug af LOC. Specifikt demonstrerer vi spånfremstilling, cellesåning på funktionelle substrater, mekanisk belastning og spåndemontering til remodellering af kvantificering. Vi mener, at forklaringen på disse teknikker drage fordel af et visuelt format.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel beskriver grundlaget for fremstilling af en knogleremodellering LOC platform for dyrkning osteocytter, osteoklaster, og osteoblaster. Ved at ændre dybden og størrelsen af brønden i chippen blev der udviklet flere konfigurationer til stimulering af osteocytter med mekanisk belastning og kvantificering af funktionelle resultater af knogleombygning (figur 1B).
Under spånsamling var optimering af plasmaoxidationsprotokollen afgørend…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation under Grant Nos. (CBET 1060990 og EBMS 1700299). Dette materiale er også baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (2018250692). Eventuelle udtalelser, resultater, konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette materiale er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.
Materials
| Acrylic sheet | Optix | — | 3.175 mm thick |
| Angled dispensing tips | Jensen Global | JG18-0.5X-90 | Remove plastic connector prior to use |
| Biopsy punch | Robbins Instruments | RBP-10 | 1 mm diameter |
| Bone wafers | Boneslices.com | 0.4 mm thick | Bovine cortical bone |
| Bovine calf serum | Hyclone | SH30072 | |
| Calipers | Global Industrial | T9F534164 | |
| Cell spatula | TPP | 99010 | |
| Chip mask | ProtoLabs | Custom-designed | Print material: Accura SL 5530 |
| Cork borer | Fisher Scientific | 07-865-10B | |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WCL | |
| Culture dish (100 mm) | Corning | 430591 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Culture dish (150 mm) | Corning | 430597 | Sterile, Non-tissue culture treated |
| Double sided tape | 3M Company | Scotch 237 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Leveling box | Custom-made | — | 3D printed |
| Masking tape | 3M Company | Scoth 2600 | |
| MC3T3-E1 preosteoblasts | ATCC | CRL-2593 | Subclone 4 |
| Mechanical loading device | Custom-made | — | 3D printed |
| Minimum essential alpha medium | Gibco | 12571-063 | |
| MLO-Y4 osteocytes | — | — | Gift from Dr. Lynda Bonewald |
| Packaging tape | Duck Brand | — | Standard packaging tape |
| Paraffin film | Bemis Parafilm | PM999 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | p4333 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Expanded plasma cleaner |
| Polydimethylsiloxane kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Polystyrene coverslips | Nunc Thermanox | 174942 | Sterile, tissue culture treated |
| Oven | Quincy Lab | 12-180 | |
| RAW264.7 preosteoclasts | ATCC | TIB-71 | |
| Scalpel | BD Medical | 372611 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain Tygon | ABW00001 | ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm) |
| SolidWorks software | Dassault Systèmes | — | Used to generate 3D printed models and perform FEA |
| Spray adhesive | Loctite | 2323879 | Multi-purpose adhesive |
| Syringe (5 ml) | BD Medical | 309646 | Sterile |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | Pump 11 Pico Plus |
| Tapered laboratory spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Two-part expoxy | Loctite | 1395391 | 5 minute quick set |
| Type I collagen | Corning | 354236 | Rat tail collagen |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42010-0000 | |
| Waterproof sealant | Gorilla | 8090001 | 100% silicone sealant |
Riferimenti
- Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
- Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
- Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
- Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
- Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
- Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
- Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
- George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , (2019).
- Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
- George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
- George, E. L. . Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).
- York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
- Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
- Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
- Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
- Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).
