Articolo metodologico

Modello di cardiomiociti ischemici e confronto video-based della contrazione cardiomiocite utilizzando cardiomiociti derivati da hiPSC

DOI:

10.3791/61104

⸱

5 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un modello di cardiopatia ischemica utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, insieme a un metodo per la valutazione quantitativa dei danni ai tessuti causati dall'ischemia. Questo modello può fornire una piattaforma utile per lo screening farmacologico e ulteriori ricerche sulle cardiopatie ischemiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cardiopatia ischemica è una causa significativa di morte in tutto il mondo. È stato quindi oggetto di un'enorme quantità di ricerca, spesso con modelli di piccoli animali come i roditori. Tuttavia, la fisiologia del cuore umano differisce significativamente da quella del cuore roditore, sottolineando la necessità di modelli clinicamente rilevanti per studiare le malattie cardiache. Qui presentiamo un protocollo per modellare le cardiopatie ischemiche utilizzando cardiomiociti differenziati dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPS-CM) e per quantificare il danno e la compromissione funzionale dei cardiomiociti ischemici. L'esposizione al 2% di ossigeno senza glucosio e siero aumenta la percentuale di cellule ferite, che è indicata dalla colorazione del nucleo con iodide propidio, e diminuisce la vitalità cellulare. Queste condizioni riducono anche la contrattilità dei hiPS-CM, come confermato dall'analisi del campo vettoriale di spostamento di immagini video microscopiche. Questo protocollo può inoltre fornire un metodo conveniente per lo screening farmacologico personalizzato facilitando l'uso di cellule hiPS da singoli pazienti. Pertanto, questo modello di cardiopatia ischemica, basato su iPS-CM di origine umana, può fornire una piattaforma utile per lo screening farmacologico e ulteriori ricerche sulle cardiopatie ischemiche.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cardiopatia ischemica (IHD) è riconosciuta in tutto il mondo come la principale causa di morte, ed è stato stimato essere responsabile di più di nove milioni di morti nel 20161. La prevalenza delle malattie cardiovascolari continua ad aumentare e la globalizzazione sembra aver contribuito alla prevalenza dei fattori di rischio per le malattie cardiache nei paesi in via di sviluppo. Pertanto, lo studio di IHD sta diventando sempre più urgente2.

I modelli sperimentali di malattia cardiovascolare sono fondamentali per studiare i meccanismi della malattia, l'accuratezza della diagnosi e lo sviluppo di nuove terapie. Molti laboratori hanno proposto diversi modelli sperimentali. È della massima importanza scegliere un modello con vantaggi significativi; la fattibilità, la ripetibilità e la somiglianza con la malattia umana sono fattori chiave nella selezione dei modelli di malattia cardiovascolare3. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) che trasportano specifiche mutazioni associate alla cardiomiopatia sono un'alternativa promettente ai modelli animali4. Anche se molte strategie sono state descritte per indurre cardiomiociti utilizzando iPSC5,6,7,8,9, qui forniamo un metodo semplice per produrre un modello IHD utilizzando cardiomiociti differenziati da hiPSC, in cui non viene applicata la laboriosa selezione di cardiomiociti utilizzando marcatori. In questo metodo, i cardiomiociti vengono selezionati funzionalmente analizzando la contrazione spontanea.

L'induzione di cardiomiociti con hiPSC evita il sacrificio animale e la chirurgia tecnicamente difficile. Stabilire modelli animali di IHD richiede tecniche chirurgicheimpegnative 10. Simulare perfettamente i vari aspetti patofsiologici delle malattie cardiache umane come la frequenza cardiaca e i potenziali di azione dalla fisiologia dei roditori è quasi impossibile. Accoppiato con la moralità e l'etica dell'utilizzo di modelli animali, lo sviluppo di nuovi modelli sperimentali diversi dai modelli animali è imperativo. I cardiomiociti differenziati dalle cellule iPS umane imitano meglio lo stato fisiologico del cuore umano. In questo protocollo, stabiliamo un modello di IHD utilizzando cardiomiociti derivati da cellule hiPS (hiPS-CM). Nel nostro modello, la privazione di ossigeno e glucosio porta ad una diminuzione della forza contrattile e della vitalità dei hiPS-CM. Il nostro metodo fornisce un nuovo approccio al modello IHD e dimostra una nuova piattaforma per lo studio di questa malattia.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cultura della manutenzione hiPSC

  1. Rivestire un piatto di coltura a sei possiedi con laminina (Tabella dei Materiali).
    1. Diluire laminina a 0,5 g/mL in salina tamponata di fosfato (PBS).
    2. Aggiungere laminina diluita a una piastra a sei possiò ad un volume di 2,0 mL/pozzo.
    3. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 30 minuti.
  2. Rimuovere la soluzione laminina dai pozzetti.
  3. Semi iPSC in 2 mL di supporto di manutenzione iPSC(Tabella dei materiali) sui pozzi rivestiti ad una densità di 3 × 104 celle/beh senza asciugare la superficie.
  4. Sottocultura gli hiPSC.
    1. Preparare la soluzione 0.5× dissociazione cellulare (Tabella deimateriali ).
      1. Mescolare 10 L di 0,5 M Etilenediaminetetraacetic (EDTA) e 10 mL di PBS per fare 0,5 mM EDTA/PBS.
      2. Diluire 10 mL di 1× enzimi di dissociazione cellulare a 0,5× aggiungendo 10 mL di 0,5 mM EDTA/PBS.
    2. Aspirare il mezzo speso dai pozzi.
    3. Aggiungere 2 mL/pozzo di PBS per lavare le celle, quindi scartare il PBS.
    4. Aggiungete 800 l degli enzimi di dissociazione cellulare 0× e incubate le cellule per 7 min a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata contenente il 5% di CO2.
      NOTA: 0.05% trypsin-EDTA può essere utilizzato per dissociare le cellule.
    5. Rimuovere delicatamente la soluzione di dissociazione × 0,5%.
    6. Lavare le celle con 2 mL PBS, quindi scartare il PBS.
      NOTA: Sii gentile perché le cellule si staccano facilmente dopo aver aggiunto la soluzione degli enzimi di dissociazione cellulare.
    7. Aggiungere 1 mL di supporto di manutenzione iPS (Tabella dei materiali) contenente 10 M Y-27632.
      NOTA: L'aggiunta di Y-27632 aumenta il tasso di sopravvivenza degli hiPSC.
    8. Sloggiare le cellule utilizzando un raschietto cellulare e raccoglierle in un tubo di centrifugamento da 15 mL.
    9. Contare il numero di celle. Regolare la densità delle celle a 1,5 × 104 celle/mL aggiungendo un supporto di manutenzione iPS contenente 10 M Y-27632.
      NOTA: Non utilizzare la centrifugazione per evitare danni alle cellule.
    10. Seme 2 mL di miscela cellulare sulla piastra a sei possidi rivestita di laminina (densità finale: 3 × 104 cellule/pozzo).
    11. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata contenente il 5% di CO2.
    12. Sostituire il supporto di coltura con il supporto di manutenzione iPS senza Y-27632 nei giorni 1, 4, 5 e 6.
  5. Sottocultura le cellule il giorno 7.
    NOTA: Sottocultura le cellule entro il giorno 7 al fine di inibire la differenziazione casuale di hiPSC.

2. Induzione della differenziazione cardiaca di hiPSC

  1. Rivestire un piatto di coltura 96-well con laminina (Tabella dei Materiali).
    1. Diluire la laminina a 1,675 g/mL con PBS.
    2. Aggiungere la soluzione di laminina diluita in una piastra da 96 possid su un volume di 0,1 mL/pozzo.
    3. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 30 minuti.
  2. Seme hiPSC su una piastra 96-well ad una densità di 3 × 104 cellule / beh.
  3. Proliferare hiPSC a 37 gradi centigradi in un incubatore umido contenente 5% CO2.
    1. Un giorno dopo, sostituire il supporto con 200 mezzi di crescita iPS l/well (Tabella dei materiali).
    2. Cambiare il supporto ogni giorno per altri 2-3 giorni fino a quando le cellule raggiungono il 70%-80% di confluenza.
  4. Applicare supporti di differenziazione.
    1. Aspirare il mezzo speso e sostituirlo lentamente con 200 L/pozzo di differenziazione pre-riscaldata media A (Tabella dei Materiali).
    2. Collocare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata contenente il 5% di CO2.
    3. Dopo 48 h, aspirare il mezzo e sostituirlo lentamente con 200 l/pozzo di differenziazione pre-riscaldata media B (Tabella dei Materiali).
    4. Collocare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata contenente il 5% di CO2.
      NOTA: È estremamente importante che i supporti di differenziazione siano mantenuti freschi. Perderanno gradualmente il loro effetto di differenziazione, in genere entro due settimane. Se necessario, aliquot nuovo mezzo e conservare a 20 gradi centigradi.
  5. Applicare un supporto di manutenzione cardiomiocato.
    1. Dopo 48 h, aspirare il mezzo e sostituirlo lentamente con 200 l/pozzo di supporto di manutenzione cardiomiocito pre-riscaldato (Tabella dei materiali).
    2. Collocare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata contenente il 5% di CO2.
    3. Sostituire il mezzo di differenziazione cardiomiocato ogni due giorni fino al giorno 30.
      NOTA: È importante che la durata dell'applicazione dei supporti di differenziazione A e B sia impostata con precisione su 48 h per garantire la sequenza di espressione precisa dei geni necessari per la differenziazione.

3. Esposizione all'ischemia

  1. Privare il mezzo di coltura di nutrienti e ossigeno.
    1. Preparare il mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) senza glucosio e siero.
    2. Mezzo di coltura aspirato dai pozzi della piastra 96-well contenente hiPS-CM.
    3. Aggiungere il mezzo privo di nutrienti ai pozzetti ad un volume di 200 L/pozzo.
  2. Collocare la piastra di coltura in un'incubatrice ipossica(Tabella dei Materiali).
  3. Infondere gas di azoto e mantenere la concentrazione interna di ossigeno al 2% e la concentrazione di CO2 al 5% per 24 h.
  4. Procedere alle analisi desiderate: ad esempio, analisi della fattibilità, valutazione della contrattilità o valutazione del danno cellulare.

4. Valutazione della fattibilità cellulare utilizzando L'analisi MTT

  1. Utilizzare il kit di analisi MTT (Tabella dei materiali) per valutare quantitativamente la fattibilità delle cellule.
    NOTA: L'esposizione a 1 mM di perossido di idrogeno in DMEM per 1 h può essere utilizzata per danneggiare le cellule (controllo positivo). L'esposizione al perossido di idrogeno da 0 mM nel DMEM può essere utilizzata per il controllo negativo.
    1. Aggiungere 10 SL di reagente MTT alle celle utilizzando un pipettor ripetuto.
    2. Mescolare delicatamente per un minuto su uno shaker orbitale.
    3. Incubare le cellule per 3-4 h a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2 del 5%. Dopo l'incubazione, il formazan prodotto nelle cellule apparirà come cristalli scuri nella parte inferiore dei pozzi.
    4. Dopo aver rimosso il supernante, sciogliere i cristalli di formazan insolubili in 100 L della soluzione di solfuro di dimetile (DMSO). Questa soluzione dissolverà i cristalli di formazan, producendo una soluzione viola.
      CAUTION: DMSO può irritare gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle. Indossare guanti adatti e protezione occhio/viso.
    5. Misurare l'assorbimento di ogni campione con un lettore di microplaia ad una lunghezza d'onda di 570 nm.

5. Valutazione della contrattilità degli iPS-CM

  1. Se non è installato, ottenere Particle Image Velocimetry ImageJ plugin11 all'https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv e installare.
  2. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, registrare le immagini video di hiPS-CM utilizzando l'obiettivo 4× a 20 fotogrammi al secondo per 10 s e salvare come "analyze.avi". Per un confronto della contrattilità tra prima e dopo l'ischemia, confermare che la posizione degli interessi è registrata.
    NOTA: Un microscopio con una fase automatizzata è utile per indirizzare la posizione di interesse. Il file del filmato deve essere in formato .avi per un'analisi successiva. In caso contrario, convertire il filmato in .avi.
  3. Creare la struttura di cartelle come indicato nella Figura 1. Un esempio di "joblist.txt" è indicato nel file supplementare.
  4. Analizzare i campi vettoriali bidimensionali discreti dello spostamento cellulare.
    1. Avviare Fiji (ImageJ) software12, andare a Plugin > Macro > Modifica e aprire "vector_analysis.ijm" (Supplementary Coding File).
    2. Fare clic su Esegui. L'analisi verrà eseguita automaticamente.
      NOTA: i vettori di spostamento D(x,y) vengono calcolati ogni 16 × 16 pixel tra il piano di riferimento (il primo fotogramma) e tutti i fotogrammi successivi (fotogrammi 1 contro 2, 1 contro 3, 1 contro 4 e così via). Il risultato viene calcolato per ogni fotogramma e salvato come "vec_x.txt" (x è un numero di fotogramma). Un vettore di spostamento massimo, M(x, y), viene definito per ogni coppia (x, y) come segue:
      figure-protocol-1
      dove k rappresenta il numero di frame in corrispondenza del quale Dk (x,y) D2 (x, y) D3 (x, y) Dn (x,y) e n indica l'ultimo fotogramma. Il risultato viene salvato come "Max_vector.txt". | M(x, y) rappresenta lo spostamento massimo causato dalla contrazione cardiomiocato nel punto di analisi (x, y). Il valore di contratto C in unità arbitrarie viene calcolato come segue:
      figure-protocol-2
      Questo valore viene salvato nella colonna 7, riga 1 nel file "Max_vector.txt". C rappresenta la somma di spostamento per tutti (x, y). Più grande è la porzione in cui lo spostamento a causa della contrazione miocardiale è grande, maggiore è il valore di C. Il campo vettoriale dello spostamento massimo, M(x, y), è sovrapposto all'immagine a contrasto di fase del primo fotogramma ("Phase_contrast.png") e salvato come "Overlaid.png". Poiché la grandezza del vettore di spostamento viene calcolata in base al primo fotogramma del video, è preferibile che i hiPS-CM siano a riposo nel periodo diastolico per il primo fotogramma.

6. Valutazione dei danni cellulari mediante citometria del flusso

  1. Diluire una soluzione da 1 mg/mL di iodide propidio a 1:1.000 in PBS.
  2. Macchiare le cellule staccate con iodide propidio.
    1. Aspirare il mezzo e posizionarlo in un tubo di centrifuga di dimensioni appropriata.
    2. Centrifugare il tubo a 1.000 × g per 5 min, e rimuovere con attenzione il supernatant in modo da non perdere le cellule sedimentate.
    3. Incubare le cellule con la soluzione di iodide propidio diluito a temperatura ambiente per 15 min al buio.
    4. Centrifugare il tubo a 1.000 × g per 5 min, e rimuovere con attenzione il supernatant in modo da non perdere le cellule sedimentate.
    5. Ricostituire le cellule in 1 mL di PBS.
      NOTA: È importante raccogliere le cellule galleggianti staccate dal supporto per quantificare con precisione il danno cellulare.
  3. Cellule attaccate alla macchia con iodide propidio.
    1. Lavare delicatamente le cellule attaccate con PBS, quindi scartare il PBS.
    2. Incubare le cellule con la soluzione di iodide propidio diluito per 15 min al buio.
    3. Aspirare la soluzione di iodide di propidio.
    4. Scollegare le celle utilizzando la trypsin dello 0,25%. Spostare la soluzione cellulare in un tubo di centrifuga.
    5. Centrifugare il tubo a 1.000 × g per 5 min, e rimuovere con attenzione il supernatant in modo da non perdere le cellule sedimentate.
    6. Ricostituire le cellule in 1 mL di PBS.
  4. Mescolare le cellule galleggianti e associate per l'analisi di ordinamento delle celle attivato dalla fluorescenza (FACS).
  5. Passare la soluzione cellulare attraverso un filtro di 30 m.
    NOTA: Il passaggio delle celle a un filtro è molto importante per una misurazione FACS accurata.
  6. Analizzare i campioni utilizzando un sistema FACS.

7. Immunostaining

  1. Correggere il campione di cella.
    1. Aspirare il mezzo di coltura.
    2. Aggiungere il 4% di paraformaldeide in PBS per 10 min a temperatura ambiente.
    3. Lavare le cellule tre volte con PBS.
      NOTA: Si consiglia una soluzione di paraformaldeide fresca per una fissazione ottimale.
  2. Permeare le cellule con 0,2% Triton X-100 per 15 min, quindi scartare il reagente.
  3. Aggiungere il 3% dell'albumina del siero bovino per bloccare le cellule per 30 min.
  4. Applicare l'anticorpo primario.
    1. Scartare la soluzione di albumina del siero bovino dalla piastra di coltura.
    2. Incubare le cellule con anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi.
    3. Rimuovere la soluzione anticorpo.
    4. Lavare le cellule tre volte con PBS.
  5. Applicare anticorpi secondari.
    1. Eliminare la soluzione PBS dalla piastra di coltura.
    2. Incubare le cellule con anticorpi secondari per 30 min a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: L'anticorpo monoclonale del topo T (TNNT2) primario viene utilizzato con una diluizione di 1:750 nel 3% BSA. L'anticorpo anti-topo di capra secondario Alexa Fluor 488-coniugato è diluito a 1:1.000 nel 3% BSA.
  6. Ulteriore colorazione del nucleo e delle fibre actin.
    1. Rimuovere la soluzione anticorpo.
    2. Incubare le cellule nel reagente di colorazione del nucleo (Tabella dei materiali) e nel reagente di colorazione actin ( Tabella deimateriali) in PBS per 30 min a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: 4', 6-diamidino-2-fenindole (DAPI) o Hoechst 33342 possono essere utilizzati per la colorazione nucleare.
    3. Lavare le cellule tre volte con PBS.
  7. Cattura immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule differenziate con successo mostrano una contrazione spontanea al microscopio (Video 1). In genere, il 50% dei pozzi mostra una contrazione spontanea in <20 giorni( Figura 1 ). La proteina marcatore cardiaco (ad esempio, cTnT) può essere utilizzata per confermare la differenziazione di successo (Figura 2).

In genere, le celle del gruppo ischemico mostrano una minore redditività nei saggi MTT (Figura 3A) e la contrattilità (Figura 3E,F, Figura supplementare 2) rispetto a quelle del gruppo di controllo normoxic. Inoltre, il rapporto tra le cellule propidium iodide-positive è più alto nel gruppo ischemico che nel gruppo di controllo (Figura 3B-D), che indica un danno cellulare più elevato.

figure-results-1
Figura 1: Struttura di cartelle per l'analisi vettoriale di spostamento tramite imageJ.
"joblist.txt" descrive il percorso dei file di filmato per ogni riga. Se ci sono tre file da analizzare, ci saranno tre cartelle (movie1, movie2 e movie3), in cui deve essere inserito "analyze.avi" (il filmato di interesse). Dopo che l'analisi è stata eseguita dal codice "vector_analysis.ijm", i file verranno generati (indicati in blu) in ogni cartella del filmato. Le informazioni memorizzate in ogni file sono spiegate in dettaglio nel testo principale. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Immagine rappresentativa della colorazione del marcatore cardiaco.
Espressione della proteina del marcatore cardiaco troponina T (cTnT). Blu: 4',6-diamidino-2-fenindole (DAPI), rosso: actin, verde: cTnT. Inset: espressione striata di cTnT, che corrisponde alla struttura sarcomere. Barra di scala, 50 m. Questa cifra è stata modificata da Wei et al.13. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Immagini rappresentative del saggio sulla fattibilità cellulare, la valutazione dei danni cellulari e la contrarità.
(A) Confronto della fattibilità cellulare (analisi MTT). Un'maggiore assorbimento indica una maggiore redditività. n - 5 per ogni condizione. (B, C e D) Analisi della citometria di flusso delle cellule macchiate di iodide di propidio (PI). Le cellule ischemiche presentano una ridotta intensità di dispersione in avanti e una maggiore fluorescenza PI, rispetto al controllo. (D) Percentuale di cellule macchiate di PI nell'analisi della citometria di flusso. n - 3 per ogni condizione. (E) Analisi della contrattilità iPS-CMs utilizzando il software ImageJ. I vettori rosso e blu indicano rispettivamente le contrazioni più grandi e più piccole. Barra di scala, 100 m. (F) Analisi quantitativa della contrazione iPS-CM tramite codice. n 3 per il controllo e n 8 per la condizione ischemica. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Per l'analisi statistica, è stato eseguito il test t di Student a due code non accoppiato. p < 0,05, p < 0,01. : p < 0.0001. Questa cifra è citata da Wei et al.13 Si pregadi fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Le cellule differenziate mostrano una contrazione spontanea al microscopio. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura supplementare 1: Analisi Kaplan-Meier della percentuale di campioni senza contrazione spontanea. Il 50% dei campioni iPS-CM ha mostrato una contrazione il giorno 20. Il giorno 30, il 64,4% dei campioni ha mostrato una contrazione. n - 83. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: Valutazione della contrattilità cardiaca. La contrattilità scalata ottenuta dividendo la contrattilità C per il numero di punti di analisi (x, y) è stata tracciata per i gruppi ischemici prima e dopo l'esposizione a 24 h di ipossia. n 3 per il controllo e n 8 per la condizione ischemica. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 3: Valutazione del contenuto dei cardiomiociti. Immunostaining di proteina marcatore cardiaco su una piastra di 96 bene. Verde: cTnT, Blu: DAPI. Il tasso delle cellule differenziate è stato calcolato in 20,7 ± 9,6% dividendo l'area della regione macchiata di cTnT per quella della regione macchiata da DAPI. Barra della scala : 1 mm. n - 4 per la condizione di controllo. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

File di codifica supplementare. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I ricercatori spesso utilizzano modelli di laboratorio di piccoli animali per condurre esperimenti IHD. Qui, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare di IHD umano per condurre tali esperimenti.

Il problema principale che un utente di questo protocollo può affrontare è il basso tasso di cardiomiociti differenziati. Dovrebbero essere adottate diverse misure con grande attenzione per migliorare il tasso di differenziazione di successo: (a) essere delicato quando pipettare perché le cellule si staccano facilmente dopo l'aggiunta del reagente enzimatico di dissociazione cellulare, (b) l'aggiunta di Y-27632 aumenta il tasso di sopravvivenza delle cellule iPS durante il distacco, e (c) la tempistica dei cambiamenti medi all'inizio della differenziazione dovrebbe essere precisamente 48 h di distanza per garantire l'espressione controllata dei geni coinvolti nella differenziazione.

Per quanto riguarda le proteine a matrice extracellulare utilizzate per rivestire la superficie della piastra di coltura, possono essere utilizzati materiali diversi dalla laminina che abbiamo usato in questo protocollo. Ad esempio, Matrigel14,15e gelatina16,17 vengono utilizzati per la coltura di manutenzione senza alimentatori di hiPSC. Secondo Haraguchi et al., hiPSCs semi su Matrigel sono stati differenziati con successo in foglio di cellule cardiache18.

Ci sono una serie di studi precedenti riguardanti i modelli di coltura per la modellazione della malattia utilizzando cardiomiociti derivati da hiPSC. Per quanto riguarda la modellazione della lesione ischemia-reperfusione, sono state introdotte manipolazioni dell'ambiente cellulare, come l'ipercalemia, l'acidosi e l'accumulo di lattati,19. Altri metodi includono la pelleting cellulare per ostacolare la diffusionedell'ossigeno 20 e l'inibizione metabolica utilizzando cianuro21. Nell'attuale protocollo, la lesione cellulare è stata ottenuta con un metodo relativamente semplice, vale a dire 24 h privazione di ossigeno e sostanze nutritive. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a considerare processi patofsiologici accurati della cardiopatia ischemica, poiché esistono effettivamente differenze tra la malattia in vivo e il modello di malattia dell'attuale protocollo, come la presenza o l'assenza di ambiente cellulare tridimensionale e sangue.

Per quanto riguarda l'aspetto tecnologico della valutazione della funzione cardiomiocite, Toepfer et al. ha segnalato un algoritmo basato su MatLab per determinare la contrazione e il rilassamento del sarcomere in hiPS-CMs22. Smith et al. ha riferito un metodo avanzato di analisi elettrofisiologica ad alto rendimento delle cellule eccitabili derivate da hiPS-CMs, utilizzando sofisticati array multielectrode con motivi nanotograficamente23,24. Il vantaggio del nostro protocollo è che richiede solo software convenzionali e materiali di consumo, come il software imageJ e piastre a 96 well.

Per quanto riguarda il livello di ossigeno nel cuore, la pressione di ossigeno nelle vene che raggiungono il cuore è pensata per essere 40 mmHg25. Secondo McDougal et al., la pressione extracellulare dell'ossigeno sotto ipossia è stimata in <12.8 mmHg26. Applicando il metodo di Rounds et al.27, la pressione dell'ossigeno nel mezzo di coltura (salinità: 35‰) sotto la condizione ipossica (2% di ossigeno) a 37 gradi centigradi trattata con il protocollo attuale è calcolata in modo da essere 14,9 mmHg, che è superiore alla stima di cui sopra. È interessante notare che, Al-Ani et al. ha riferito che c'è un gradiente di pressione dell'ossigeno nel mezzo di coltura, e la pressione dell'ossigeno è influenzata dal tipo di cellula, densità di semina, e volume medio28. Tipicamente, la concentrazione di ossigeno nella parte inferiore della piastra di coltura in cui risiedono le cellule è la più bassa. Pertanto, l'effetto della profondità nel mezzo di coltura ridurrebbe ulteriormente l'effettiva pressione dell'ossigeno vicino a singhiozzi. Al fine di indurre danni sufficienti ai sistemi hiPS-VM utilizzando condizioni ipossiche, è necessario prestare attenzione alla profondità del mezzo e alla densità delle cellule.

Il nostro modello hiPS-CM, che è molto vicino alle condizioni fisiologiche dei miociti cardiaci umani, imita in modo vantaggioso l'IHD umano. Gli approcci basati su modelli animali includono questioni etiche, tecniche e accademiche. In particolare, i modelli in vivo richiedono una tecnica avanzata di microchirurgia per ottenere dati riproducibili: ad esempio, l'occlusione del ramo discendente anteriore dell'arteria coronaria sinistra nei roditori3. Il modello hiPS-CM descritto nel punto di riferimento supera queste barriere critiche e fornisce una piattaforma utile, rilevante e ripetibile per le malattie cardiovascolari.

Tuttavia, alcune limitazioni dovrebbero essere notate. Un'ovvia differenza tra cardiomiociti iotti da iPS e cardiomiociti normali è l'assenza di tubuli T29, e non abbiamo includere fattori umoristici come danni ai tessuti indotti da leucociti e attivazione di un sistema di complemento nel nostro studio. Inoltre, il tasso di cardiomiociti differenziati in questo modello (20,7 ± 9,6%, Figura supplementare 3) dovrebbe essere migliorato. La recente pubblicazione di Halloin et al. descrive un metodo scalabile e definito chimicamente per indurre la purezza hiPS-CM di >95% da modulatori di vie WNT chimici senza alcun requisito di alcuna selezione da parte dei marcatori30. Tuttavia, il nostro modello di IHD umano è relativamente semplice e clinicamente applicabile (ad esempio, lo screening farmacologico utilizzando cellule iPS derivate dal paziente). Il nostro modello è anche una piattaforma unica per chiarire ulteriormente i meccanismi sottostanti gli IED.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Gli autori riconoscono con gratitudine il Central Research Laboratory, Okayama University Medical School per l'assistenza di FACS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente per la colorazione dell'actina (reagente ActinRed 555 ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37112
Anticorpo anti troponina T cardiacaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAMA5-12960
Terreno di mantenimento dei cardiomiociti (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Enzimi di dissociazione cellulare (TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA12563011
Terreno di differenziazione A (PSC Cardiomyocyte Differenziation Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Terreno di differenziazione B (PSC Cardiomyocyte Differenziation Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
SistemaFACS Aria IIIBD Biosciences, San Jose, CA, USA
Microscopio fluorescenteKEYENCE, Osaka, GiapponeBZ-X710
Anti-topo di capra Alexa Fluor 488 anticorpo secondarioThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA28175
Cellule iPS umaneRIKEN, Tsukuba, Giappone201B7
Incubatrice ipossicaSANYO, Osaka, GiapponeMCO-175M
Terreno di crescita iPSC (Essential 8 Medium)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA1517001
terreno di mantenimento iPSC (StemFit AK02N)Ajinomoto, Tokyo, GiapponeRCAK02N
laminina (iMatrix-511)Nippi, Tokyo, GiapponeiMatrix-511
MTT (kit di analisi della proliferazione cellulare MTT)Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA10009365
Reagente per colorazione del nucleo (Reagente NucBlue Fixed Cell ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, Kyoto, Giappone35501-02
Kit di analisi

Riferimenti

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