यहां, हम प्राथमिक माउस डोपामाइन न्यूरॉन्स में न्यूरोनल α-सिन्यूक्लिन संचय का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। न्यूरॉन्स में फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन समुच्चय पूर्व-गठित α-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल्स के साथ प्रेरित होते हैं। इम्यूनोफ्लोरोसेंशली लेबल कोशिकाओं और निष्पक्ष छवि विश्लेषण की स्वचालित इमेजिंग इस मजबूत प्रोटोकॉल को दवाओं की मध्यम से उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त बनाती है जो α-सिन्यूक्लिन संचय को रोकती है।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्राथमिक डोपामाइन न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन संचय का एक मजबूत और प्रजनन योग्य मॉडल स्थापित करना है। इम्यूनोस्टेपिंग और निष्पक्ष स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त, यह मॉडल न्यूरोनल संस्कृतियों में α-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण पर दवाओं और आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभावों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। प्राथमिक मिडब्रेन संस्कृतियां सदाशयी भ्रूण डोपामाइन न्यूरॉन्स का एक विश्वसनीय स्रोत प्रदान करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, पार्किंसंस रोग, लेवी बॉडीज (एलबी) की हॉलमार्क हिस्टोपैथोलॉजी, सीधे न्यूरोनल कल्चर मीडिया को α-सिन्यूक्लिन प्री-स्ट्रगल फिब्रिल्स (पीएफएफ) के अलावा की नकल है। डोपामाइन न्यूरॉन्स के सोमा में अंतर्जात फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन का संचय पीएफएफ अतिरिक्त के 7 दिनों के बाद पहले से ही इम्यूनोदाता द्वारा पता लगाया जाता है। इन विट्रो सेल संस्कृति की स्थिति छोटे अणु दवाओं और न्यूरोट्रोफिक कारकों जैसे α-सिन्यूक्लिन संचय को रोकने वाले उपचारों के आवेदन और मूल्यांकन के साथ-साथ आनुवंशिक हेरफेर के लिए लेंटीवायरस वैक्टर (उदाहरण के लिए, CRISPR/Cas9 के साथ) के लिए भी उपयुक्त हैं। 96 अच्छी तरह से प्लेटों में न्यूरॉन्स culturing मजबूती और प्रयोगात्मक सेटअप की शक्ति बढ़ जाती है। प्रयोग के अंत में, कोशिकाओं को इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ तय किया जाता है। मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस छवियों को 96 अच्छी तरह से प्लेटों की स्वचालित माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। इन आंकड़ों को मात्रा निर्धारित किया गया है (उदाहरण के लिए, प्रति अच्छी तरह से फास्फो-α-सिन्यूक्लिन युक्त डोपामाइन न्यूरॉन्स की संख्या की गिनती) मुफ्त सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ जो निष्पक्ष उच्च सामग्री फेनोटाइप विश्लेषण के लिए एक मंच प्रदान करता है। प्राथमिक डोपामाइन न्यूरॉन्स में फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन संचय के पीएफएफ-प्रेरित मॉडलिंग उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और सेलुलर फेनोटाइप विश्लेषण के अवसर के साथ, α-सिन्यूक्लिन समावेशन के अंतर्निहित तंत्र मध्यस्थता और उन्मूलन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो सब्स्तानटिया निग्रा (एसएन) में मिडब्रेन डोपामाइन न्यूरॉन्स की मौत, बेसल गंगलिया में डोपामाइन टोन के बाद के नुकसान, और परिणामस्वरूप मोटर हानि1,,2की विशेषता है। पीडी रोगियों के दिमाग में एक प्रमुख हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषता न्यूरोनल सोमा में पाए जाने वाले इंट्रासेलुलर प्रोटीन/लिपिड समुच्चय हैं, जिन्हें लेवी बॉडीज (एलबी) कहा जाता है, या न्यूराइट्स में, लेवी न्यूराइट्स (एलएन), सामूहिक रूप से लेवी पैथोलॉजी 3 के रूप में जानाजाताहै । मस्तिष्क में लेवी विकृति न्यूरोनल कनेक्शन के माध्यम से रोगजनक कारकों के प्रसार जैसी पीडी को आगे बढ़ाने के साथ प्रगति करने के लिए प्रकट होती है। एसएन में डोपामाइन न्यूरॉन्स और न्यूरोडिजेनरेशन4से प्रभावित अन्य क्षेत्रों में कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में लेवी पैथोलॉजी पाई जाती है । हालांकि, रोग प्रगति के दौरान, प्रोटीन एकत्रीकरण का प्रसार और शुरुआत हमेशा न्यूरोनल मृत्यु से सहसंबंधित नहीं होती है और न्यूरोनल डेथ में लेवी पैथोलॉजी का सटीक योगदान अभी भी अस्पष्ट है5।
एलबी और एलएन में झिल्लीदार और प्रोटीनसियस कंपोनेंट्स3से मिलकर दिखाया गया था । पूर्व झिल्ली के टुकड़े, वेसिकुलर संरचनाएं (संभवतः लाइसोसोम और ऑटोफगोसोम) और माइटोकॉन्ड्रिया3हैं। उत्तरार्द्ध में कम से कम 300 विभिन्न प्रोटीन होते हैं6. स्पिलेंटिनी एट अल7 द्वारा एक बानगी अध्ययन से पता चला है कि लेवी पैथोलॉजी का प्रमुख प्रोटीन घटक α-सिन्यूक्लिन है। न्यूरॉन्स में अत्यधिक व्यक्त किया गया है, और झिल्ली संलयन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज से जुड़ा हुआ है, लेवी पैथोलॉजी में α-सिन्यूक्लिन ज्यादातर गलत मुड़ा हुआ, एमिलॉयड फिब्रिल रूप में मौजूद है, जिनमें से अधिकांश सेर129 (pS129-αsyn)4,,8में फॉस्फोरिलेटेड है।
महत्वपूर्ण बात यह भी है कि यह भी प्रदर्शित किया गया था कि इसके prion की तरह गुणों के कारण, गलत मुड़ा हुआ α-सिन्यूक्लिन लेवी पैथोलॉजीगठन 4में एक कारक भूमिका हो सकती है । गलत मुड़ा हुआ α-सिन्यूक्लिन के प्रियोन जैसे गुणों को रोगियों से मिडब्रेन अर्क के साथ दिखाया गया था और संस्कृति में न्यूरॉन्स में और वीवो9,,10में α-सिन्यूक्लिन प्रीफेड फिब्रिल्स (पीएफएफ) तैयार करने के लिए एक्सोजेनसली रूप से तैयार किया गया था। पीएफएफ डोपामाइन न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत मॉडल पेश करता है। जब पीपीएफ को सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स पर लागू किया जाता है या पशु मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है, तो वे न्यूराइट्स और सेल सोमा11 में α-सिन्यूक्लिन युक्त समावेशन के गठन का कारण बनते हैं जो लेवी पैथोलॉजी में देखी गई कई विशेषताओं को पुनः प्राप्त करते हैं। मनाया समावेशन ट्राइटन एक्स में डिटर्जेंट-अघुलनशील होते हैं, सर्वव्यापी, एमिलॉयड विशिष्ट डाई थिओफ्लेविन एस से सना हुआ होता है, और इसमें सेर12911,,12में α-सिन्यूक्लिन हाइपरफॉस्फोस्फोरिलेटेड होते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि ये समावेश α-सिन्यूक्लिन नॉकआउट जानवरों11में नहीं बनते हैं, जो अंतर्जात α-सिन्यूक्लिन पर उनके गठन की निर्भरता का संकेत देते हैं।
फिर भी, पीडी रोगियों में पाए जाने वाले पीएफएफ-प्रेरित समावेशन और लेवी पैथोलॉजी की सीधे तुलना करना मुश्किल है क्योंकि मानव एलबीएस और एलएन अत्यधिक विषम3हैं। लेवी पैथोलॉजी की देखी गई विषमता गठन के विभिन्न चरणों, विभिन्न शारीरिक स्थान, या एकत्रीकरण प्रक्रिया शुरू करने वाले गलत मुड़ा हुआ α-सिन्यूक्लिन के अनुरूपता में अंतर के कारण हो सकती है। यही कारक पीएफएफ-प्रेरित pS129-αsyn सकारात्मक समावेशन को प्रभावित कर सकते हैं। दरअसल, हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में PFF-प्रेरित pS129-αsyn सकारात्मक समावेशन विकृति के बहुत शुरुआती चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो लंबे समय तक इनक्यूबेशन अवधि12,,13के बाद एलबी जैसी संरचनाओं के लिए परिपक्व हो सकते हैं।
पीएफएफ के साथ गलत α-सिन्यूक्लिन का जल्दी फैलने और संचय करना दवा विकास के लिए मूल्यवान है, क्योंकि लेवी पैथोलॉजी स्प्रेड को प्रारंभिक चरण के रोग मार्कर में से एक माना जाता है। इसलिए, एकत्रीकरण-निवारक उपचार बहुत शुरुआती चरणों में पीडी की प्रगति को रोकने या धीमा करने के लिए वादा किया जा सकता है। α-सिन्यूक्लिन संचय को धीमा या रोकने के उद्देश्य से कई नैदानिक परीक्षण चल रहे हैं14। बाद के चरण के रोगियों के लिए, डोपामाइन न्यूरोनल जनकों का प्रत्यारोपण एक बेहतर उपचार विकल्प15हो सकता है । हालांकि, लेवी पैथोलॉजी पीडी रोगी दिमाग16, 17,17के पोस्टमार्टम विश्लेषण के दौरान प्रत्यारोपित भ्रूण न्यूरॉन्स में प्रलेखित किया गया था, यह भी α-yynuclein संचय के खिलाफ सुरक्षा की आवश्यकता का संकेत है ।
इन विट्रो में, α-सिन्यूक्लिन पीएफएफ को कृंतक प्राथमिक हिप्पोकैम्पस या कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अमर कोशिका रेखाओं में या अधिक सामान्यतः एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। इनमें से कोई भी डोपामाइन न्यूरॉन्स10को फिर से काटने के करीब नहीं हैं । इन न्यूरॉन्स को बनाने के लिए विट्रो18में कुछ संख्या में न्यूरॉन्स की सघन चढ़ाना होता है । सीमित सामग्री (जैसे, प्राथमिक डोपामाइन न्यूरॉन्स) के साथ उच्च चढ़ाना घनत्व प्राप्त करने के लिए, माइक्रो द्वीप संस्कृति विधि आमतौर पर उपयोग किया जाता है। माइक्रो आइलैंड कल्टिंग में, कोशिकाओं को शुरू में मध्यम की एक छोटी बूंद (आमतौर पर कुछ माइक्रोलीटर) में चढ़ाया जाता है जो एक बड़े कुएं18के बीच में सतह तनाव से एक साथ रखा जाता है। न्यूरॉन्स संलग्न करने के बाद, पूरा कुआं माध्यम से भर जाता है जबकि कोशिकाएं छोटे चढ़ाना क्षेत्र में उच्च घनत्व पर सीमित रहती हैं। उच्च चढ़ाना घनत्व प्राप्त करने के अलावा, सूक्ष्म द्वीप भी कुओं के किनारों के पास चढ़ाना रोकते हैं, जहां सेल घनत्व और अस्तित्व में भिन्नता अक्सर होती है । सूक्ष्म द्वीपों का उपयोग अक्सर अपेक्षाकृत बड़े कुओं या व्यंजनों में किया जाता है; हालांकि, 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में सूक्ष्म द्वीपों में मिडब्रेन न्यूरोनल संस्कृतियों की स्थापना मध्यम-से-उच्च-थ्रूपुट शक्ति के साथ सदाशयी डोपामाइन न्यूरॉन्स में लेवी पैथोलॉजी का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है। इन न्यूरॉन्स के साथ विट्रो प्रयोगों ने हमें ग्लियल सेल लाइन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (जीडीएनएफ) की खोज करने की अनुमति दी, जो विट्रो में परिपक्व डोपामाइन न्यूरॉन्स के अस्तित्व को बढ़ावा देता है और वीवो19,20,,,21,,22 में और डोपामाइन न्यूरॉन्स23में α-सिन्यूक्लिन समुच्चय के गठन को भी रोकता है। मानव रोगी प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न डोपामाइन न्यूरॉन्स उनके मानव मूल और विट्रो में लंबे समय तक जीवित रहने के समय के कारण एक अधिक सटीक मॉडल का गठन । हालांकि, मानव न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी का प्रेरण कई महीनों के बाद मनाया जाता है, माउस भ्रूणीय न्यूरॉन्स में एक सप्ताह की तुलना में, और/या कई तनावों के साथ (उदाहरण के लिए, α-सिन्यूक्लिन ओवरएक्सप्रेशन और पीएफएफ का संयोजन)24,,25। इसके अलावा, प्राथमिक भ्रूणीय न्यूरॉन्स की तुलना में मानव डोपामाइन न्यूरॉन्स का रखरखाव अधिक महंगा और श्रमसाध्य होता है, अनिवार्य रूप से उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों में उनके उपयोग को सीमित करता है।
इसके अलावा, प्राथमिक डोपामाइन न्यूरोनल संस्कृतियों को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, CRISPR/Cas9 के साथ) और/या औषधीय एजेंटों के साथ इलाज23। वे आणविक मार्ग विच्छेदन और दवा पुस्तकालय स्क्रीनिंग जैसे अनुप्रयोगों के लिए एक तेज और प्रजनन योग्य मंच का गठन करते हैं। यद्यपि इन संस्कृतियों से सीमित सामग्री प्राप्त की जा सकती है, फिर भी छोटे आकार के जीनोमिक्स/प्रोटेओमिक्स विश्लेषण करना संभव है । 96 अच्छी तरह से प्रारूप में प्राथमिक न्यूरॉन्स को बाहर करना इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए बेहतर है, जिसके बाद उच्च सामग्री फेनोटाइप विश्लेषण किया जाता है। 96 अच्छी प्लेटों की स्वचालित इमेजिंग से प्राप्त मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस छवियों को मात्रात्मक परिणामों में परिवर्तित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, प्रति अच्छी तरह से एलबी युक्त न्यूरॉन्स की संख्या)। इस तरह के विश्लेषण मुफ्त सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है, जैसे सेलप्रोफिलर26,,27। कुल मिलाकर, 96 अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया प्राथमिक भ्रूण मिडब्रेन संस्कृतियां उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइप स्क्रीनिंग के अवसर के साथ डोपामाइन न्यूरॉन्स और α-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और कुशल मंच प्रदान करती हैं।
लेवी पैथोलॉजी का प्रसार, जिसमें से PS129-αsyn एक प्रमुख घटक है, पीडी की एक हिस्टोपैथोलॉजिकल बानगी है। एकत्रित pS129-αsyn के संचय को रोकना या धीमा करना डोपामाइन न्यूरॉन्स के पतन और अल्फा-सिन्यूक्लियिनोपैथी की प्रगति को धीमा कर सकता है। हालांकि, कैसे pS129-αsyn एकत्रीकरण डोपामाइन न्यूरॉन्स के निधन के लिए योगदान देता है की एक यंत्रवादी समझ अभी भी स्थापित किया जाना है । रोग के विभिन्न चरणों में रोगियों से मस्तिष्क के नमूनों पर मानव पोस्टमॉर्टम अध्ययन के साक्ष्य के साथ – साथ प्रत्यारोपित भ्रूण न्यूरॉन्स में pS129-αsyn सकारात्मक समावेश के अवलोकन से कोशिकाओं के बीच लेवी विकृति के प्रसार का दृढ़ता से पता चलता है16,17,,33।, नतीजतन, PS129-αsyn के prion की तरह फैल हाल ही में α-सिन्यूक्लिन PFFs9,,10का उपयोग करके पुनर्निर्धारित किया गया था । विशेष रूप से डोपामाइन न्यूरॉन्स में PS129-αsyn प्रसार और संचय के एक मजबूत, लागत प्रभावी, और अपेक्षाकृत उच्च या मध्यम-थ्रूपुट मॉडल की स्थापना, इस प्रक्रिया को संशोधित करने वाले उपन्यास उपचार और यौगिकों की खोज को काफी गति दे सकती है।
क्योंकि डोपामाइन न्यूरॉन्स का नुकसान पीडी में मोटर लक्षणों का मुख्य कारण है और इन कोशिकाओं में कई अद्वितीय गुण हैं2,,34,,35,डोपामाइन न्यूरॉन्स में PS129-αsyn के प्रेशन जैसे प्रसार की मॉडलिंग ट्रांसलेशनल परिप्रेक्ष्य से मॉडल का सबसे प्रासंगिक प्रकार है। 4 अच्छी प्लेटों और अर्धस्वचालित मात्राकरण पर भ्रूणीय मिडब्रेन न्यूरॉन्स की सूक्ष्म द्वीप संस्कृतियों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल पहले18वर्णित किए गए हैं । यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 96 अच्छी तरह से प्लेटों के अनुकूल बनाया गया था और सूक्ष्म द्वीपों की कम श्रमसाध्य तैयारी प्रदान करता है, जिससे एक कार्यदिवस के दौरान एक अनुभवी शोधकर्ता द्वारा 60 कुओं वाले चार प्लेटों को तैयार करने की अनुमति मिलती है। 96 अच्छी प्लेटों में डोपामाइन न्यूरॉन्स को बनाने से कम मात्रा में दवाओं के परीक्षण की अनुमति होती है और लेंटीवायरस वैक्टर के साथ उच्च ट्रांसडक्शन दरों को सक्षम बनाता है। अधिक जटिल प्रयोग करने के लिए विभिन्न उपचारों को जोड़ना भी संभव है।
किसी भी उपचार (PFFs सहित) लागू करने से पहले, खेती की गुणवत्ता उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की जानी चाहिए । यदि माइक्रोस्कोपी प्रणाली हीटिंग के साथ एक CO2 कक्ष का उपयोग नहीं करता है, कोशिकाओं को कुछ मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेटर के बाहर नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि प्राथमिक माउस डोपामाइन न्यूरॉन्स नाजुक और आसानी से जोर दिया जाता है । इसी कारण से, यह सलाह दी जाती है कि पहली इमेजिंग इनक्यूबेशन के 24 घंटे (DIV1-DIV3 के बीच) के बाद की जानी चाहिए। कोशिकाओं को वर्तमान कोशिका निकायों के साथ जीवित होना चाहिए और सूक्ष्म द्वीप के अंदर समरूप रूप से फैल जाना चाहिए । प्राथमिक न्यूरॉन्स पीओ-लेपित जमीन पर बस गए होंगे और न्यूरोनल अनुमानों को स्थापित करना शुरू कर दिया होगा। कोशिकाओं के छोटे झुरमुट (यानी, व्यास 150-200 माइक्रोन से छोटा) का निरीक्षण करना संभव है जो यदि ट्रियूशन प्रक्रिया ठीक से नहीं की जाती है या प्लेटिंग घनत्व अनुशंसित से अधिक होता है तो बनाया जा सकता है। इन छोटे झुरमुट प्रयोग को प्रभावित नहीं होगा, जब तक कि वे अच्छी तरह से कुछ प्रति अधिक कर रहे है और/ झुरमुट कोशिकाओं को छवि विश्लेषण के दौरान इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मार्कर और व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करना बहुत मुश्किल हो जाता है। सावधानीपूर्वक कोटिंग, ट्रिटरिंग और प्लेटिंग घनत्व को नियंत्रित करके ऐसे झुरमुटों से बचना आवश्यक है। यदि कुछ कुओं पर इन शर्तों की एकरूपता नहीं देखी जा सकती है, तो प्रयोग में इन दोषपूर्ण कुओं को शामिल न करें । इस तरह के बहिष्कार किसी भी उपचार के निष्पादन से पहले किया जाना चाहिए ।
इसके अलावा, 96 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान सुविधाजनक मल्टीचैनल पिपेट उपयोग के लिए अनुमति देता है और स्वचालित प्लेट माइक्रोस्कोप के साथ प्रत्यक्ष दृश्य, आगे बढ़ते थ्रूपुट। उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफार्मों से डेटा के विश्लेषण के लिए स्वचालित छवि मात्राकरण का उपयोग अपरिहार्य है। प्रत्येक प्रयोग से प्राप्त हजारों छवियों को संसाधित करने की क्षमता के अलावा, यह सभी उपचार समूहों के निष्पक्ष, समान मात्राकरण सुनिश्चित करता है। छवि विश्लेषण के लिए प्रस्तावित कार्यप्रवाह डोपामाइन न्यूरॉन्स को खंडित करने के सरल सिद्धांतों पर आधारित है, पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग द्वारा सही ढंग से खंडित कोशिकाओं को फ़िल्टर करना, और बाद में फेनोटाइप (pS129-αsyn सकारात्मक और PS129-αsyn नकारात्मक) का मात्राकरण, फिर से पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग द्वारा। यद्यपि इस कार्य के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोणों की कल्पना की जा सकती है, हमने उच्च चढ़ाना घनत्व, डोपामाइन न्यूरॉन्स के विविध आकारों और दृढ़ता से दाग वाले न्यूराइट्स की उपस्थिति के कारण डोपामाइन संस्कृतियों के लिए मशीन लर्निंग के साथ विभाजन का संयोजन पाया है। प्रस्तावित छवि विश्लेषण एल्गोरिदम को सेलप्रोफिलर और सेलप्रोफिलर विश्लेषक, ओपन सोर्स, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर26,,27में लागू किया गया था। एल्गोरिदम को अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ भी लागू किया जा सकता है, या तो ओपन सोर्स (जैसे, इमेजजे/फिजी, KNIME) या मालिकाना। हालांकि, हमारे अनुभव में ये अक्सर उपयोग में आसानी के लिए अनुकूलन क्षमताओं का बलिदान करते हैं, और इसलिए जटिल विश्लेषणों में अच्छा प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं। हमने पाया है कि सेलप्रोफिलर और सेलप्रोफिलर विश्लेषक सॉफ्टवेयर पैकेज पर्याप्त संख्या में लागू एल्गोरिदम, वर्कफ़्लो डिजाइन करने में अत्यधिक लचीलापन, और साथ ही उच्च सामग्री इमेजिंग डेटा को संभालने और कुशलता से संसाधित करके विशेष रूप से विश्वसनीय परिणाम देते हैं।
वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा विशेषता वाले अन्य सेलुलर फेनोटाइप के मात्राकरण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि अन्य न्यूरोनल आबादी के मार्कर (जैसे, डैट, जीएडी 67, 5-एचटी आदि) और प्रोटीन समुच्चय (जैसे, फॉस्पो-ताऊ, सर्वव्यापक) । कई फ्लोरोसेंट मार्कर को कई फेनोटाइप (उदाहरण के लिए, परिपक्वता के विभिन्न चरणों में समावेशन के साथ कोशिकाओं) को अलग करने के लिए भी जोड़ा जा सकता है। कई फेनोटाइप का स्वचालित वर्गीकरण भी वर्णित छवि विश्लेषण पाइपलाइनों में केवल एक चैनल जोड़कर लागू करना आसान होना चाहिए जिसमें अतिरिक्त मार्कर की इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियों को मापन चरणों में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को कई डिब्बे में छांटता है। हालांकि, एक ही समय में कई मार्कर के उपयोग के लिए इम्यूनोस्टेटिंग और इमेजिंग स्थितियों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग में बेहतर गुणवत्ता के लिए, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए स्पष्ट रूप से डिज़ाइन की गई विशेष काले दीवारों वाली 96 अच्छी प्लेटों के उपयोग की सिफारिश की जाती है। हालांकि, ये मानक सेल कल्चर प्लेटों की तुलना में काफी अधिक महंगे हो सकते हैं, जो हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं।
प्रयोगों के परिणाम के लिए उपयोग किए गए पीएफएफ का प्रकार और गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। PFFs दोनों परख की मजबूती और परिणामों की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं । तैयारी की स्थिति पीएफएफ की सीडिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है और, वास्तव में, विभिन्न शारीरिक गुणों के साथ पीएफएफ “उपभेदों” को36बताया गया है। फिर भी , पीएफएफ की तैयारी और सत्यापन इस लेख के दायरे,से बाहर है और इसका वर्णन11, 28 ,29,,30के कई प्रकाशनों में किया गया है .29 तैयारी प्रोटोकॉल के अलावा, पीएफएफ (जैसे, माउस, मानव) में α-सिन्यूक्लिन की उत्पत्ति की प्रजातियों और जंगली प्रकार या उत्परिवर्तित प्रोटीन (जैसे, मानव A53T α-ynuclein) के उपयोग पर विशेष प्रयोगात्मक परिस्थितियों के आधार पर विचार किया जाना चाहिए। पीएफएफ द्वारा PS129-αsyn संचय का प्रेरण संस्कृति की आयु (यानी, विट्रो में दिन) पर निर्भर दिखाया गया था, जिसमें अधिक परिपक्व संस्कृतियों को अधिक स्पष्ट प्रेरण11दिखाया गया था। यह शायद अधिक परिपक्व संस्कृतियों में न्यूरोनल कनेक्शन की बढ़ी हुई संख्या के कारण है, और α-सिन्यूक्लिन प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई है। हमारे हाथों में, DIV8 में PFFs के साथ उपचार सबसे मजबूत परिणाम दिया, डोपामाइन न्यूरॉन सोमा में pS129-αsyn के स्पष्ट संचय के साथ, जबकि न्यूरोनल अस्तित्व समझौता नहीं है । वर्णित प्रोटोकॉल प्रारंभिक घटनाओं को संशोधित करने वाले उपचारों का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जिससे अंतर्जात α-सिन्यूक्लिन का एकत्रीकरण होता है क्योंकि हम पीएफएफ के साथ टीका लगाने के 7 दिनों बाद अपेक्षाकृत शुरुआती समय बिंदु पर PS129-αsyn सकारात्मक समावेशन की मात्रा निर्धारित करते हैं। इस समय बिंदु पर, इंट्रासोमल समावेश कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण अंश में मौजूद होते हैं और आसानी से इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है जबकि कोई पीएफएफ-प्रेरित सेल मृत्यु नहीं देखी जाती है, परिणामों की व्याख्या को सरल बनाता है। महत्वपूर्ण बात, के रूप में आकृति विज्ञान और PFF की संरचना प्रेरित समावेशन समय12,,13के साथ बदल सकते हैं, वर्णित प्रोटोकॉल, सिद्धांत रूप में, निर्धारण और बाद के समय अंक पर इम्यूनोदाता द्वारा अधिक परिपक्व समावेशन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । हालांकि, 15 दिनों से अधिक समय तक संस्कृति में डोपामाइन न्यूरॉन्स रखने के लिए अत्यधिक देखभाल की आवश्यकता होती है, और PFF टीका से स्वतंत्र रूप से जीवित रहने में विफल रहने वाली कोशिकाओं के कारण अतिरिक्त भिन्नता पैदा हो सकती है। इसके अतिरिक्त, अधिक विस्तारित संस्कृतियों दवा उपचार कार्यक्रम जटिल । कई यौगिकों सीमित है या नहीं खराब कोशिका संस्कृति माध्यम में स्थिरता की विशेषता है, और एक दवा की भरपाई तुच्छ नहीं है क्योंकि मध्यम समझौते के पूर्ण विनिमय डोपामाइन संस्कृतियों के अस्तित्व ।
Ser129 में α-yynuclein के फॉस्फोरिलेशन लगातार पीएफएफ-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण के मॉडल आधारित है और थिओफ्लाविन एस, सर्वव्यापकता, या संरचना-विशिष्ट एंटीबॉडी11, 12,जैसे गलत और एकत्रीकरण के मार्कर के साथ कोलोकैलिज़ कियाजाताहै। हमारे हाथों में, PS129-αsyn के लिए इम्यूनोस्टेटिंग भी सबसे कम पृष्ठभूमि के साथ सबसे मजबूत संकेत देता है और विश्लेषण करने के लिए सबसे सीधा है, मजबूत परिणाम दे जब कई उपचार की जांच कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, PS129-αsyn एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोशेपिंग पीएफएस का पता नहीं लगाता है जो कोशिकाओं के बाहर रहते हैं, पृष्ठभूमि को काफी कम करते हैं। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि Ser129 फॉस्फोरिलेशन शायद α-सिन्यूक्लिन के गलत गुना से जुड़ी शुरुआती प्रक्रियाओं में से एक है और विशिष्ट परिस्थितियों में अलग-अलग विनियमित किया जा सकता है। इसलिए, PS129-αsyn पर सकारात्मक प्रभाव दिखाने वाले किसी भी निष्कर्ष की पुष्टि अन्य मार्कर द्वारा की जानी चाहिए।
सांख्यिकीय विश्लेषण तदनुसार प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुरूप होना चाहिए। कम से कम तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति (यानी, अलग प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों) में प्रयोग करना आवश्यक है। इन प्रतिकृति को विभिन्न प्लेटों पर चढ़ाया जाना चाहिए और स्वतंत्र रूप से इलाज किया जाना चाहिए। हम विभिन्न प्रायोगिक प्लेटों के लिए डेटा की पेयरिंग को ध्यान में रखने के लिए यादृच्छिक ब्लॉक डिजाइन एवोवा37 के साथ विभिन्न प्लेटों पर प्रतिकृति से प्राप्त डेटा का विश्लेषण करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रो केल्विन लुक को इम्यूनो दाग कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए α-सिन्यूक्लिन पीएफएफ, कोंजुंग झेंग को न्यूरोनल कोशिकाओं की स्थापना और खेती करने के लिए उनके उदार उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं, और हेलसिंकी विश्वविद्यालय के जैव प्रौद्योगिकी संस्थान में लाइट माइक्रोस्कोपी यूनिट। इस काम को बिजनेस फिनलैंड (फिनिश फंडिंग एजेंसी फॉर इनोवेशन), फिनलैंड #309489, #293392, #319195 अकादमी द्वारा 3i-उत्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन, और मेजर इंस्टीट्यूट ऑफ फार्माकोलॉजी, पीए, पोलैंड के सांविधिक धन।
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |