Здесь мы представляем подробный протокол для изучения нейронального накопления в первичных нейронах допамина мыши. Фосфорилированные агрегаты синаклеин в нейронах индуцируются с предварительно сформированными фибриллами с синуклеином. Автоматизированная визуализация иммунофлуоресцентов, маркированных клетками, и объективный анализ изображений делают этот надежный протокол подходящим для скрининга средней и высокой пропускной способности препаратов, которые препятствуют накоплению синуклеина.
Целью этого протокола является создание надежной и воспроизводимой модели накопления в первичных допаминовых нейронах. В сочетании с иммуносетяционным и непредвзятым автоматизированным анализом изображений, эта модель позволяет анализировать влияние лекарств и генетических манипуляций на агрегацию в нейронных культурах. Первичные культуры среднего мозга обеспечивают надежный источник добросовестных эмбриональных нейронов допамина. В этом протоколе, отличительной чертой гистопатологии болезни Паркинсона, Lewy органов (LB), имитируется добавлением к-синуклеин предварительно сформированных фибрилл (PFFs) непосредственно нейронных средств культуры. Накопление эндогенного фосфорилированного синауклеина в соме дофаминовых нейронов обнаруживается путем иммуносхеи уже через 7 дней после добавления PFF. Условия культуры клеток in vitro также подходят для применения и оценки методов лечения, предотвращающих накопление синаклеина, таких как небольшие молекулярные препараты и нейротрофические факторы, а также лентивирусные векторы для генетических манипуляций (например, с CRISPR/Cas9). Культивирование нейронов в 96 пластин скважин увеличивает надежность и мощность экспериментальных установок. В конце эксперимента клетки фиксируются параформальдегидом для иммуноцитохимии и флуоресценции микроскопии. Многоспектральные изображения флуоресценции получены с помощью автоматизированной микроскопии 96 пластин скважины. Эти данные количественно (например, подсчет количества фосфо-синуклеин-содержащих дофаминовых нейронов на скважину) с использованием свободного программного обеспечения, которое обеспечивает платформу для беспристрастного анализа фенотипа высокого содержания. PFF-индуцированное моделирование фосфорилированного накопления в первичных нейронах допамина обеспечивает надежный инструмент для изучения основных механизмов посредничества формирования и ликвидации включения в синаклеин, с возможностью для высокопроизводительного скрининга наркотиков и клеточного анализа фенотипа.
Болезнь Паркинсона (PD) является нейродегенеративным расстройством характеризуется смертью среднего мозга допамина нейронов в substantia nigra (SN), последующая потеря тон допамина в базальных ганглиев, и последующие нарушения двигателя1,2. Основными гистопатологическими особенностью в мозге пациентов PD являются внутриклеточные белковые/липидные агрегаты, найденные в нейрональных сомах, называемых телами Леви (LB), или в невритах, Льюи невриты (LN), коллективно известный как патология Леви3. Патология Lewy в мозге кажется, что развивает с выдвигая PD напоминая распространение патогенных факторов через соединения нейронов. Обильные патологии Льюи находится в дофаминовых нейронов в SN и клеток в других областях, пострадавших от нейродегенерации4. Однако, во время прогрессирования заболевания, распространения и начала агрегации белка не всегда коррелируют с нейронной смерти и точный вклад патологии Леви к нейрональной смерти до сих пор неясно5.
Было показано, что LB и LN состоят из мембранных и белковых компонентов3. Первыми являются мембранные фрагменты, везикулярные структуры (возможно, лизосомы и аутофагосомы) и митохондрии3. Последний состоит не менее чем из 300 различных белков6. Отличительное исследование Spillantini et al.7 показало, что основным белковым компонентом патологии Леви является з-синуклеин. Высоко выраженный в нейронах, и связаны с мембранного синтеза и нейромедиатора релиз, З-синуклеин в патологии Леви присутствует в основном в неправильно, амилоидной фибрилевой форме, основная часть которых фосфорилированных на Ser129 (pS129-syn)4,8.
Важно отметить, что было также продемонстрировано, что из-за его прионоподобные свойства, неправильно сложенный з-синуклеин может иметь причинную роль в формировании патологии Леви4. Прион-подобные свойства неправильно сложенных q-synuclein были показаны как с экстрактами среднего мозга от пациентов, так и с экзогенно подготовленными к-синуклеин преформированных фибрилл (PFFs), чтобы вызвать агрегаты в нейронах в культуре и in vivo9,10. ПФФы представляют надежную и надежную модель для изучения прогрессирования синуклейской патологии в дофаминовых нейронах. Когда ПФФы применяются к культивируемым первичным нейронам или вводят в мозг животного, они приводят к образованию синуклеин-содержащих включений в неврит и клеточной соме11, которые резюмируют многие особенности, наблюдаемые в патологии Лью. Наблюдаемые включения моющих средств нерастворимы в Triton X, вездесущие, окрашенные с амилоидной специфической красителя Thioflavin S, и содержат гиперфосфорилированный в Ser12911,12. Важно отметить, что эти включения не образуются в з-синуклеин нокаут животных11, что свидетельствует о зависимости их формирования на эндогенных з-синуклеин.
Тем не менее, трудно напрямую сравнить PFF-индуцированных включений и патологии Леви найти у пациентов PD, потому что человек LBs и LNs очень неоднородные3. Наблюдаемая неоднородность патологии Леви может быть вызвана различными стадиями формирования, разным анатомическим расположением или различиями в конформации неправильно сложенных синаклеев, инициирующего процесс агрегации. Те же факторы могут повлиять на PFF-индуцированных pS129-зин положительных включений. Действительно, недавно было продемонстрировано, что PFF-индуцированных pS129-Зин положительные включения в первичных нейронных культур представляют собой очень ранние стадии патологии, которые могут созреть до структур, очень напоминающих LB после длительного инкубационного периода12,13.
Моделирование раннего распространения и накопления неправильно сложенных с помощью ПФФ является ценным для разработки лекарств, так как распространение патологии Леви считается одним из маркеров заболевания на ранней стадии. Таким образом, агрегации-профилактического лечения может быть перспективным для остановки или замедления прогрессирования PD на очень ранних стадиях. Несколько клинических испытаний, направленных на замедление или прекращение накопления синауклеина, продолжаются14. Для пациентов более поздней стадии, трансплантация допамина нейрональных прародителей может быть лучшей альтернативой лечения15. Тем не менее, патология Лью была задокументирована в пересаженных эмбриональных нейронов во время посмертного анализа PD пациента мозга16,17, также указывает на необходимость защиты от накопления синуклеин.
В пробирке, С-synuclein PFFs, как известно, вызывают агрегацию в увековеченных клеточных линий, или чаще, в грызунов первичных гиппокампа или корковых нейронов. Ни один из них близки к перепросмотру допамина нейронов10. Культивирование этих нейронов требует плотного покрытия определенного количества нейронов in vitro18. Для достижения высокой плотности покрытия с ограниченным материалом (например, первичных нейронов допамина), микро-остров культивирования метод обычно используется. В культивирование микро-острова, клетки первоначально покрыны в небольшой капле среднего (обычно несколько микролитров) хранятся вместе поверхностным натяжком в середине большого колодца18. После того, как нейроны прикрепляются, весь колодец заполняется средой, в то время как клетки остаются ограниченными при высокой плотности в небольшой области покрытия. В дополнение к достижению высокой плотности покрытия, микро-острова также предотвратить покрытие вблизи краев скважин, где изменения в плотности клеток и выживания являются частыми. Микро-острова часто используются в относительно больших колодцах или посуде; Однако, устанавливать midbrain нейрональные культуры в микро-островах в формате плиты 96 well позволяет изучение патологии Lewy в добросовестных нейронах допамина с medium-to-high-through-мощностью. Эксперименты в пробирке с этими нейронами позволили нам обнаружить глиальные клеточные нейротрофический фактор (GDNF), который способствует выживанию зрелых дофаминовых нейронов in vitro и in vivo19,20,21,22, а также предотвращает образование агрегатов в допаминовых нейронах23., Человеческие пациент-индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные дофаминовые нейроны представляют собой более точную модель из-за их человеческого происхождения и больше времени выживания в пробирке. Тем не менее, индукция патологии з-синуклеин в человеческих нейронах наблюдается после нескольких месяцев, по сравнению с неделей в эмбриональных нейронах мыши, и / или с несколькими стрессорами (например, сочетание переэкспрессии и ПФФ)24,25. Кроме того, поддержание нейронов допамина человека является более дорогостоящим и трудоемким по сравнению с первичными эмбриональными нейронами, существенно ограничивая их использование в высокопроизводительных приложениях.
Кроме того, первичные нейронные культуры допамина могут быть генетически модифицированы (например, с CRISPR/Cas9) и/или лечиться фармакологическими агентами23. Они представляют собой быструю и воспроизводимую платформу для таких приложений, как вскрытие молекулярных путей и скрининг библиотеки наркотиков. Несмотря на то, что ограниченный материал может быть получен из этих культур, все еще можно провести небольшой размер геномики / протеомики анализ. Культирование первичных нейронов в формате 96 хорошо лучше для иммуноцитохимии и методов флуоресценции микроскопии, а затем анализ фенотипа высокого содержания. Многоспектральные изображения флуоресценции, полученные в результате автоматической визуализации 96 пластин скважин, могут быть преобразованы в количественные результаты (например, количество LB-содержащих нейронов на колодец). Такие анализы можно сделать со свободными программами, такими как CellProfiler26,27. В целом, первичные эмбриональные культуры среднего брайна, покрынные в 96 пластинах скважин, обеспечивают надежную и эффективную платформу для изучения дофаминовых нейронов и агрегации с высокопроизводительным фенотипом.
Распространение патологии Льюи, из которых pS129-зин является основным компонентом, является гистопатологической отличительной чертой PD. Остановка или замедление накопления агрегированных pS129-зин может замедлить дегенерацию нейронов допамина и прогрессирование альфа-синуклеинопатии. Тем не менее, механистическое понимание того, как агрегация pS129-syn способствует кончине дофаминовых нейронов еще предстоит установить. Доказательства из человеческих посмертных исследований на образцы мозга у пациентов на разных стадияхзаболевания,а также наблюдения pS129-Зин положительное включение в пересаженных нейронов плода сильно предполагает распространение патологии Льюи между клетками16,17,33. Следовательно, прион-как распространение pS129-Syn был недавно перепроверяется с помощью С-synuclein PFFs9,10. Создание надежной, рентабельной и относительно высокой или средней пропускной модели распространения и накопления pS129-syn, особенно в дофаминовых нейронах, может значительно ускорить поиск новых методов лечения и соединений, изменяющих этот процесс.
Потому что потеря допамина нейронов является основной причиной двигательных симптомов в PD и эти клетки обладают многими уникальными свойствами2,34,35, моделирование прион-как распространение pS129-‘syn в допамина нейронов является наиболее актуальным типом модели с трансляционной точки зрения. Протоколы с использованием микро-островных культур эмбриональных нейронов среднего мозга на 4 пластины колодца и полуавтоматической количественной оценки были описаны ранее18. Протокол, описанный здесь, был адаптирован к 96 плитам скважины и обеспечивает менее трудоемкую подготовку микроресутов, что позволяет подготовить до четырех плит, содержащих по 60 скважин каждый опытным исследователем в течение одного рабочего дня. Культивирование нейронов допамина в 96 пластин скважинах позволяет тестировать лекарства в меньших количествах и обеспечивает высокую скорость трансдукции с лентивирусными векторами. Также можно сочетать различные методы лечения для выполнения более сложных экспериментов.
Перед применением любых процедур (в том числе ПФФ), качество культивирования следует проверить с помощью ярко-полевой микроскопии. Если система микроскопии не использует камеру CO2 с нагреванием, клетки не должны храниться за пределами инкубатора более чем на пару минут, потому что первичные нейроны допамина мыши деликатны и легко подчеркнул. По той же причине, рекомендуется сделать первое изображение после 24 ч инкубации (между DIV1-DIV3). Клетки должны казаться живыми с настоящими клеточными телами и однородно распространяться внутри микро-острова. Первичные нейроны поселились бы на земле с покрытием PO и начали устанавливать нейронные проекции. Можно наблюдать небольшой скопление клеток (т.е. диаметр меньше 150-200 мкм), которые могут быть сформированы, если процесс тритурации не выполнен должным образом или плотность покрытия выше рекомендованной. Эти небольшие скопления не повлияет на эксперимент, если они не более чем на несколько за колодец и / или больше. В ходе анализа изображений клеток, в результате анализа изображений, имохистохимические маркеры и отдельные клетки очень затрудняют выявление иммуногистохимических маркеров и отдельных клеток. Важно избегать таких комков путем тщательного покрытия, тритурации и контроля плотности покрытия. Если единообразие этих условий не может наблюдаться на определенных скважинах, не включайте эти дефектные скважины в эксперимент. Такое исключение должно быть сделано до проведения каких-либо процедур.
Кроме того, использование 96 пластин скважин позволяет удобно использовать многоканальный пипетки во время процедур окрашивания и прямой визуализации с помощью автоматических пластинных микроскопов, что еще больше увеличивает пропускную способность. Использование автоматизированной количественной оценки изображений необходимо для анализа данных с платформ изображений с высоким содержанием изображения. В дополнение к возможности обработки тысяч изображений, полученных от каждого эксперимента, он обеспечивает беспристрастную, идентичную количественную оценку всех групп лечения. Рабочий процесс, предложенный для анализа изображений, основан на простых принципах сегментации дофаминовых нейронов, фильтрации правильно сегментированных клеток путем контролируемого машинного обучения, а затем количественной оценки фенотипов (pS129-syn положительных и pS129-syn отрицательных), опять же путем контролируемого машинного обучения. Хотя несколько различных подходов для этой задачи могут быть предусмотрены, мы обнаружили, сочетание сегментации с машинным обучением, чтобы быть наиболее надежным для допамина культур из-за высокой плотности покрытия, разнообразные формы дофамин нейронов, и наличие сильно окрашенных невритов. Предлагаемый алгоритм анализа изображений был реализован в CellProfiler и CellProfiler Analyst, с открытым исходным кодом, свободно доступном программном обеспечении для анализа изображений с высоким содержанием26,,27. Алгоритм может быть также реализован с другим программным обеспечением для анализа изображений, либо с открытым исходным кодом (например, ImageJ/FIJI, KNIME), либо несвободным. Тем не менее, по нашему опыту, эти часто жертвуют возможностями настройки для простоты использования, и, следовательно, не может работать хорошо в сложных анализов. Мы обнаружили, что пакеты программного обеспечения CellProfiler и CellProfiler Analyst дают особенно надежные результаты, сочетая значительное количество реализованных алгоритмов, чрезвычайную гибкость в разработке рабочего процесса, а также одновременное обращение и эффективную обработку данных изображений с высоким содержанием.
Описанный протокол также может быть адаптирован для количественной оценки других клеточных фенотипов, характеризующихся иммуносхозированием с различными антителами, такими как маркеры других нейронных популяций (например, DAT, GAD67, 5-HT и т.д.) и белковые агрегаты (например, фоспо-Тау, убиквитин). Несколько флуоресцентных маркеров можно также объединить для различения нескольких фенотипов (например, клеток с включениями на разных стадиях созревания). Автоматизированная классификация нескольких фенотипов также должна быть легко реализована в описанных трубопроводах анализа изображений, просто добавив канал, содержащий иммунофлуоресцентные изображения дополнительных маркеров для измерения шагов и сортировки ячеек в несколько бункеров. Однако использование нескольких маркеров одновременно потребует оптимизации иммуносубийства и визуализации. Кроме того, для лучшего качества в иммунофлуоресценции изображений, использование специальных черностенных 96 пластин хорошо явно предназначен для флуоресцентного микроскопа рекомендуется. Тем не менее, они могут быть значительно дороже, чем стандартные пластины клеточной культуры, которые достаточны для анализа, описанного в нашем протоколе.
Тип и качество используемых ПФФ имеют решающее значение для результатов экспериментов. PFFs могут как влиять на надежность анализа, так и на интерпретацию результатов. Условия подготовки могут повлиять на эффективность посева ПФФ и, действительно, PFF “деформации” с различными физиологическими свойствами были зарегистрированы36. Тем не менее, подготовка и проверка ПФФ выходят за рамки данной статьи и были описаны в нескольких публикациях11,28,29,30. В дополнение к протоколу подготовки, виды происхождения з-синуклеина в ПФФАх (например, мышь, человек) и использование дикого типа или мутировавшего белка (например, человека A53T и синуклеин) должны быть рассмотрены, в зависимости от конкретных экспериментальных условий. Индукция накопления pS129-зин ПФФ было показано, что зависит от возраста культуры (т.е. дней в пробирке), с более зрелыми культурами, показывающими более выраженную индукцию11. Это, вероятно, связано с увеличением числа нейронных связей в более зрелых культур, а также увеличение уровня белка к-синуклеин. В наших руках, лечение ПФФ на DIV8 дал самые надежные результаты, с выраженным накоплением pS129-зин в допамина нейрон сома, не ставя под угрозу выживание нейронов. Описанный протокол хорошо подходит для изучения методов лечения, изменяющих ранние события, ведущие к агрегации эндогенных синуклеин, потому что мы количественно pS129-syn положительных включений в относительно ранний момент времени, 7 дней после прививки с PFFs. В настоящее время, внутрисомные включения присутствуют в значительной части клеток и могут быть легко различимы по иммуносхеи, в то время как не PFF-индуцированной клеточной смерти наблюдается, упрощая интерпретацию результатов. Важно отметить, что, как морфология и состав PFF-индуцированных включений может меняться с течениемвремени 12,13, описанный протокол может, в принципе, быть изменены для изучения более зрелых включений фиксации и иммуносуляции в более поздние точки времени. Однако, сохраняя дофамин нейронов в культуре более 15 дней требует крайней внимательности, и может вызвать дополнительные изменения из-за клеток не в состоянии выжить независимо от прививки PFF. Кроме того, более расширенные культуры усложняют графики лечения наркомании. Многие соединения имеют ограниченную или не плохо характеризуется стабильность в среде клеточной культуры, и пополнение препарата не тривиально, потому что полный обмен среды ставит под угрозу выживание культур допамина.
Фосфорилирование й-синуклеина на Ser129 постоянно сообщается в PFF-моделях агрегации и колокалиона с маркерами неправильного сворачивания и агрегации, таких как Тиофлавин S, убиквитин, или конформации конкретных антител11,12. В наших руках, иммуносу предпосылки для pS129-syn также дает самый сильный сигнал с самым низким фоном и наиболее прост для того чтобы проанализировать, давая надежные результаты когда множественные обработки экранированы. Важно отметить, что иммуносулятивная с антителами pS129-syn не обнаруживает ПФФ, которые остаются вне клеток, значительно уменьшая фон. Тем не менее, важно помнить, что фосфорилирование Ser129, вероятно, является одним из самых ранних процессов, связанных с неправильное сворачивание с синуклеина и может быть по-разному регулируется при определенных условиях. Таким образом, любые выводы, которые показывают положительное влияние на pS129-зин должны быть подтверждены другими маркерами.
Статистический анализ должен быть соответствующим образом адаптирован к экспериментальному проектированию. Важно проводить эксперименты по крайней мере в трех независимых биологических репликациях (т.е. отдельных первичных нейрональных культурах). Эти репликации должны быть покрыты на разных пластинах и рассматривать самостоятельно. Мы анализируем данные, полученные из репликаций на различных пластинах со случайным дизайном блока ANOVA37, чтобы учесть сопряжение данных для различных экспериментальных пластин.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Келвина Лука за его щедрый дар ПФФ «Синжуклеин», Конджунг Чжэн за создание и культивирование нейронных клеток, и подразделение световой микроскопии в Институте биотехнологии Хельсинкского университета, для визуализации иммунооптональных клеток. Эта работа была поддержана грантами от 3i-Regeneration компанией Business Finland (Финское агентство по финансированию инноваций), Академией Финляндии #309489, #293392, #319195; Фонд Сигрид Джуселиус и уставные фонды Института фармакологии Май, ПАС, Польша.
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |