Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale
Summary
Un metodo per la fornitura di cellule staminali neurali, adattabile per l’iniezione di soluzioni o sospensioni, attraverso l’arteria carotide comune (mouse) o l’arteria carotide esterna (ratto) dopo ictus ischemico è segnalato. Le cellule iniettate sono distribuite ampiamente in tutto il parenchyma cerebrale e possono essere rilevate fino a 30 d dopo la consegna.
Abstract
La terapia con cellule staminali neurali (NSC) è un trattamento innovativo emergente per ictus, lesioni cerebrali traumatiche e disturbi neurodegenerativi. Rispetto alla consegna intracranica, la somministrazione intra-arteriosa delle NSC è meno invasiva e produce una distribuzione più diffusa delle NSC all’interno del parenchyma cerebrale. Inoltre, la somministrazione intra-arteriosa consente l’effetto del primo passaggio nella circolazione cerebrale, dimezzando il potenziale di intrappolamento delle cellule negli organi periferici, come il fegato e la milza, una complicazione associata alle iniezioni periferiche. Qui, dettagliamo la metodologia, sia nei topi che nei ratti, per la consegna delle NSC attraverso l’arteria carotide comune (topo) o l’arteria carotide esterna (ratto) all’emisfero ipsilaterale dopo un ictus ischemico. Utilizzando NSC con etichetta tramite GFP, illustriamo la distribuzione diffusa ottenuta in tutto l’emisfero roditore ipsilaterale a 1 d, 1 settimana e 4 settimane dopo la consegna postischemica, con una maggiore densità all’interno o vicino al sito di lesioni ischemiche. Oltre alla sopravvivenza a lungo termine, dimostriamo di differenziare le cellule etichettate con GFP a 4 settimane. L’approccio di consegna intra-arteriosa descritto qui per le NSC può essere utilizzato anche per la somministrazione di composti terapeutici, e quindi ha un’ampia applicabilità a vari modelli di lesioni e malattie del SNC in più specie.
Introduction
La terapia con cellule staminali (SC) ha un enorme potenziale come trattamento per malattie neurologiche, tra cui ictus, trauma cranico e demenza1,2,3,4,5,6. Tuttavia, un metodo efficiente per fornire SC esogeni al cervello malato rimane problematico2,6,7,8,9,10,11,12,13.6 Le SC consegnate attraverso percorsi di consegna periferici, tra cui l’iniezione endovevenosa (IV) o intraperitoneale (IP), sono soggette a filtraggio del primo passaggio nella microcircolazione, soprattutto nei polmoni, nel fegato, nella milza e nel muscolo8,9,13,14, aumentando le probabilità di accumulo di cellule in aree non bersaglio. Il metodo invasivo di iniezione intracerebrale si traduce in danni ai tessuti cerebrali localizzati e una distribuzione molto limitata di SC vicino al sito di iniezione2,6,8,14,15,16. Recentemente abbiamo stabilito un metodo di iniezione intra-arterioso basato su catetere per fornire SC neurali esogeni (NSC), che è descritto qui applicato in un modello di roditore di ictus ischemico focale. Induciamo una lesione transiente (1 h) ischemia-reperfusione in un emisfero utilizzando un filamento rivestito in gomma di silicone per occludere l’arteria cerebrale centrale sinistra (MCA) nel topo o ratto17,18,19. In questo modello abbiamo osservato in modo riproducibile circa il 75-85% di depressione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) nell’emisfero ipsilaterale con Laser Doppler o Laser speckle imaging17,19, producendo deficit neurologici coerenti17,18,19.
Per risparmiare tempo, il video è impostato per giocare a velocità normale e procedure chirurgiche di routine come la preparazione della pelle e la chiusura della ferita con sutura e l’uso e la configurazione della pompa siringa motorizzata non sono presentati. Il metodo di somministrazione intra-arteriale delle NSC è dimostrato nel contesto del modello di occlusione dell’arteria cerebrale centrale (MCAO) di ictus sperimentale nei roditori. Pertanto, includiamo la procedura di ictus ischemico transitorio al fine di dimostrare in seguito come il secondo intervento chirurgico, l’iniezione intra-arteriale, viene eseguita utilizzando il sito chirurgico precedente sullo stesso animale. La fattibilità della distribuzione intra-arteriale di NSC nei modelli di corsa dei roditori è dimostrata valutando la distribuzione e la sopravvivenza delle NSC esogene. L’efficacia della terapia NSC per attenuare la patologia cerebrale e la disfunzione neurologica sarà riportata separatamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia con cellule staminali per le malattie neurologiche è ancora in una fase esplorativa precoce. Un problema importante è che non esiste un metodo stabilito per la consegna sufficiente di SC o NSC nel cervello.
Anche se sC/NSC esogeni possono essere rilevati nel cervello dopo per via endovenosa (IV), intraperitoneale (IP) o iniezione intraarenchymal/intracerebrale, ogni approccio di consegna ha drawbacks. Si stima che la popolazione rilevabile all’interno del cervello sia molto bassa …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata da quanto segue: AHA Award 14SDG20480186 per LC, Team di innovazione soggetto della Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 per La B , e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust concedere 14-12A per KES e LC.
Materials
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
Riferimenti
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force – Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
