쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램
Summary
신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSC) 치료는 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 신경 퇴행성 질환에 대한 새로운 혁신적인 치료법입니다. 두개 내 전달과 비교하여 NSC의 동맥 내 투여는 덜 침습적이며 뇌 완두엽종 내에서 NSC의 확산 분포를 생성합니다. 또한, 동맥 내 전달은 뇌 순환에 있는 첫번째 통과 효력을 허용하고, 말초 주사와 관련되었던 간 및 비장과 같은 말초 기관에 있는 세포의 포획을 위한 잠재력을 감소시킵니다. 여기서, 우리는 일반적인 경동맥(mouse) 또는 외부 경동맥(rat)을 통해 NSC를 허혈성 뇌졸중 후 입시측반구로 전달하는 방법론을 상세히 설명한다. GFP 라벨NSC를 사용하여, 우리는 허혈성 상해 사이트 또는 그 근처에 더 높은 밀도로, 사후 전달 후에 1 d, 1 주 및 4 주에 설치류 ipsilateral 반구를 통해 달성된 광범위한 분포를 보여줍니다. 장기 생존 이외에, 우리는 4 주에 GFP 표지 된 세포의 분화의 증거를 보여줍니다. NSC를 위해 여기에서 기술된 동맥 내 전달 접근은 또한 치료 화합물의 관리에 사용될 수 있고, 따라서 다중 종에 걸쳐 다양한 CNS 상해 및 질병 모형에 광범위한 적용성을 가지고 있습니다.
Introduction
줄기세포(SC) 치료는 뇌졸중, 두부 외상 및 치매1,,,2,23, 4,4,55,6을포함한 신경질환 치료제로서 엄청난 잠재력을 지니고 있다. 그러나, 병이 있는 뇌에 외인성 SC를 전달하는 효율적인 방법은 문제가있는 2,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13으로남아 있다. 정맥 내(IV) 또는 관면(IP) 주사를 포함한 주변 전달 경로를 통해 전달되는 SC는 미세 순환, 특히 폐, 간, 비장 및 근육8,,9,,13,,14에서미세 순환에서 첫 번째 통과 필터링의 대상이 되며, 비표적 영역에서 세포의 축적 가능성을 증가시킵니다. 침습적 인트레이스레브렐 주사 방법은 국소화된 뇌 조직 손상 및 주사 부위,,2,6,8,14,,15,16근처의 SC의 매우 제한된분포를초래한다., 최근에는 카테터 기반 동맥 내 주입 방법을 수립하여 외인성 신경 SC(NSC)를 전달하며, 여기서 설명되는 이 방법은 초점 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에 적용되고 있다. 마우스,또는 쥐(17, 18,19)에서좌중뇌동맥(MCA)을 폐백시키기 위해 실리콘 고무 코팅 필라멘트를 이용하여17,한 반구에서 과도(1h) 허혈-재퍼퓨전 손상을 유도한다.18 본 모델에서 우리는 레이저 도플러 또는 레이저 반점 이미징17,19,일관된 신경 적자17,18,19를가진 ipsilateral 반구에서 대뇌 혈류(CBF)의 약 75-85%의 우울증을 재현적으로 관찰하였다.17,,
시간 절약을 위해, 비디오는 정상 속도의 두 배로 재생하도록 설정되어 있으며, 봉합사를 사용한 피부 제제 및 상처 폐쇄와 같은 일상적인 외과 적 수술과 전동 주사기 펌프의 사용 및 설정은 제시되지 않습니다. NSC의 동맥 내 전달 방법은 설치류에서 실험적인 뇌졸중의 중간 뇌동맥 폐색(MCAO) 모델의 맥락에서 입증된다. 따라서, 우리는 나중에 두 번째 수술, 동맥 내 주사가 동일한 동물에 이전 수술 부위를 사용하여 수행되는 방법을 보여주기 위해 일시적인 허혈성 뇌졸중 절차를 포함한다. 설치류 스트로크 모델에서 동맥 내 NSC 전달의 타당성은 외인성 NSC의 분포와 생존을 평가함으로써 입증된다. 뇌 병리학 및 신경 기능 장애를 감쇠하는 NSC 치료의 효능은 별도로 보고될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 질환에 대한 줄기 세포 치료는 여전히 초기 탐사 단계에 있습니다. 한 가지 주요 문제는 뇌에 SC 또는 NSC를 충분히 전달하기위한 확립 된 방법이 없다는 것입니다.
외인성 SC/NSC는 정맥(IV), 복막 내(IP) 또는 인트라파렌실/인트레이스렐 브레브렐 주사에 이어 뇌에서 검출될 수 있지만, 각 전달 접근법은 단점이 있다. 뇌 내의 검출 가능한 인구는 말초 주입 (IV 또는 IP)으로 매?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 다음과 같은 에 의해 지원되었다: AHA 상 14SDG20480186 LC에 대한, BZ에 대한 산시 대학의 주제 혁신 팀 2019-QN07, 켄터키 척수 및 머리 부상 연구 신뢰 부여 14-12A KES와 LC에 대한.
Materials
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
Riferimenti
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force – Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
