क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPिशन-एक्सोक्यूलेसेज (सीआईपी-एक्सो) का उपयोग करके माउस स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का उच्च-संकल्प मानचित्रण
Summary
जीन नियमन को समझने के लिए जीनोम में प्रोटीन-बाध्यकारी स्थानों का सटीक निर्धारण महत्वपूर्ण है । यहां हम एक जीनोमिक मैपिंग विधि का वर्णन करते हैं जो एक्सोन्यूक्लियेज पाचन (सीआईपी-एक्सो) के साथ क्रोमेटिन-इम्यूनोप्रिपिशिटेटेड डीएनए का इलाज करता है और इसके बाद उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण होता है। यह विधि स्तनधारी न्यूरॉन्स में बेस-पेयर मैपिंग रिज़ॉल्यूशन और उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का पता लगाती है।
Abstract
जीन नियमन को समझने के लिए जीनोम पर विशिष्ट प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान महत्वपूर्ण है । क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिcipitेशन के साथ मिलकर उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का व्यापक रूप से डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के जीनोम-व्यापी बाध्यकारी स्थानों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, ChIP-seq विधि सोनिकेटेड डीएनए टुकड़े और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि डीएनए की लंबाई में अपनी विषमता से सीमित है, जिसके परिणामस्वरूप कम मानचित्रण संकल्प और डीएनए बाध्यकारी साइटों में अनिश्चितता । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक्सोक्यूक्लिज पाचन (सीआईपी-एक्सो) के साथ चिप का संयोजन प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग साइट पर विषम आकार के इम्यूनोप्रिपिटेटेड डीएनए को ट्रिम करने के लिए 5 ‘से 3’ एक्सोन्यूक्लिज पाचन का उपयोग करता है। एक्सोक्यूलेस उपचार गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि डीएनए को भी समाप्त करता है। पुस्तकालय द्वारा तैयार और एक्सोक्यूलेज-पचाए गए डीएनए को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए भेजा जा सकता है। ChIP-exo विधि अधिक से अधिक पता लगाने संवेदनशीलता और कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ आधार जोड़ी मानचित्रण संकल्प के पास के लिए अनुमति देता है । स्तनधारी कोशिकाओं और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक अनुकूलित ChIP-exo प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है।
Introduction
प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन के स्थान जीन विनियमन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिcipitेशन के साथ-साथ उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का उपयोग एक दशक के लिए जीवित कोशिकाओं में जीनोम-वाइड प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की जांच करने के लिए किया गया है1,2। हालांकि, ChIP-seq विधि डीएनए विखंडन और अनबाउंड डीएनए संदूषण में विषमता से सीमित है जो कम मानचित्रण संकल्प, झूठी सकारात्मक, मिस्ड कॉल और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत का कारण बनती है। एक्सोक्यूक्लिज पाचन (सीआईपी-एक्सो) के साथ सीआईपी का संयोजन प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग पॉइंट्स पर सीआईपी डीएनए को ट्रिम करके, बेस-पेयर रिज़ॉल्यूशन और कम पृष्ठभूमि सिग्नल3,4,5के पास प्रदान करके चित-सेक्यू विधि में सुधार करता है। बहुत बेहतर मानचित्रण संकल्प और कम पृष्ठभूमि ChIP द्वारा प्रदान की-exo सटीक और व्यापक प्रोटीन डीएनए बाध्यकारी स्थानों जीनोम भर में निर्धारित करने के लिए अनुमति देते हैं । सीआईपी-एक्सो कार्यात्मक रूप से अलग डीएनए-बाध्यकारी रूपांकनों, ट्रांसक्रिप्शन कारकों (टीएफ) के बीच सहकारी बातचीत, और एक निश्चित जीनोमिक बाध्यकारी स्थान में कई प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग साइटों को प्रकट करने में सक्षम है, अन्य जीनोमिक मानचित्रण विधियों द्वारा पता लगाने योग्य नहीं है3,4,6,7।
ChIP-exo शुरू में नवोदित खमीर में इस्तेमाल किया गया था TFs के अनुक्रम विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी की जांच करने के लिए, प्रतिलेखन पूर्व दीक्षा परिसर के सटीक संगठन का अध्ययन करने केलिए, और जीनोम4,8,9भर में व्यक्तिगत हिस्टोटोन की उप-नाभिक संरचना । 20114में इसकी शुरुआत के बाद से, चिप-एक्सो का बैक्टीरिया, चूहों और मानव कोशिकाओं सहित कई अन्य जीवों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है7,10,11,12,13,14,15, 16,17। 2016 में, री एट अल14 ने पहली बार स्तनधारी न्यूरॉन्स में ChIP-exo का उपयोग किया ताकि यह समझा जा सके कि प्रोग्रामिंग टीएफ एलएचएक्स 3 के डाउनरेगुलेशन के बाद न्यूरोनल जीन अभिव्यक्ति को कैसे बनाए रखा गया था, जो एक अन्य प्रोग्रामिंग टीएफ Isl1 के साथ एक हेट्रोडिमर कॉम्प्लेक्स बनाता है। इस अध्ययन से पता चला है कि Lhx3 की अनुपस्थिति में, Isl1 को न्यूरोनल प्रभावक जीन की जीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए Onecut1 TF द्वारा बंधे नए न्यूरोनल बढ़ाने के लिए भर्ती किया जाता है । इस अध्ययन में, ChIP-exo ने खुलासा किया कि कैसे कई टीएफ गतिशील रूप से कोशिका प्रकार और सेल चरण-विशिष्ट डीएनए नियामक तत्वों को निकट-न्यूक्लियोटाइड मैपिंग रिज़ॉल्यूशन पर संयोजन तरीके से पहचानते हैं। अन्य अध्ययनों में भी अन्य स्तनधारी कोशिका लाइनों में प्रोटीन और डीएनए के बीच परस्पर क्रिया को समझने के लिए ChIP-exo विधि का इस्तेमाल किया । हान एटअल. 7 ने चिप-एक्सो का उपयोग करके माउस एरिथ्रोइड कोशिकाओं में GATA1 और TAL1 TFs के जीनोम-वाइड संगठन की जांच करने के लिए ChIP-exo का उपयोग किया। इस अध्ययन में पाया गया कि TAL1 सीधे डीएनए के लिए भर्ती के बजाय परोक्ष रूप से प्रोटीन के माध्यम से-erythroid भेदभाव भर में GATA1 के साथ प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के माध्यम से । हाल के अध्ययनों में सीटीसीएफ, आरएनए पॉलीमरेज II के जीनोम-वाइड बाध्यकारी स्थानों को प्रोफाइल करने के लिए चिप-एक्सो का भी उपयोग किया गया, और मानव सेल लाइनों18, 19में एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्शनल तंत्रों का अध्ययन करने के लिए हिस्टोन के निशान।
3,5,20उपलब्ध चिप-एक्सो प्रोटोकॉल के कई संस्करण हैं। हालांकि, इन ChIP-exo प्रोटोकॉल शोध जो अगली पीढ़ी अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी से परिचित नहीं है के लिए पालन करने के लिए मुश्किल हैं । ChIP-exo प्रोटोकॉल का एक उत्कृष्ट संस्करण आसानी से पालन करने वाले निर्देशों और एक वीडियो21के साथ प्रकाशित किया गया था, लेकिन इसमें कई एंजाइमेटिक कदम शामिल थे जिन्हें पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है। यहां हम कम एंजाइमेटिक चरणों और इनक्यूबेशन समय वाले ChIP-exo प्रोटोकॉल के एक नए संस्करण की रिपोर्ट करते हैं, और प्रत्येक एंजाइमेटिक चरण21के लिए स्पष्टीकरण देते हैं। अंत की मरम्मत और डीए-टेलिंग प्रतिक्रियाओं को अंत तैयारी एंजाइम का उपयोग करके एक ही चरण में जोड़ा जाता है। इंडेक्स और यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन स्टेप्स के लिए इनक्यूबेशन बार एक लिगेशन बढ़ाने का उपयोग करके 2 घंटे से घटाकर 15 मिनट कर दिया जाता है। पिछले ChIP-exo प्रोटोकॉल में वर्णित इंडेक्स एडाप्टर लिगेशन चरण के बाद किनेज़ प्रतिक्रिया को हटा दिया जाता है। इसके बजाय, ओलिगो डीएनए संश्लेषण के दौरान एक फॉस्फेट समूह को इंडेक्स एडाप्टर(टेबल 1)के 5 सिरों में से एक में जोड़ा जाता है, जिसका उपयोग लैम्ब्डा एक्सोक्यूल्यूलस पाचन चरण के लिए किया जाएगा। जबकि पिछले ChIP-exo प्रोटोकॉल ने एकल फंसे डीएनए संदूषकों को खत्म करने के लिए RecJf exonuclease पाचन का इस्तेमाल किया, यह पाचन कदम यहां हटा दिया जाता है क्योंकि यह ChIP-exo पुस्तकालय की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण नहीं है । इसके अलावा, ChIP elution के बाद रिवर्स-क्रॉसलिंक डीएनए को शुद्ध करने के लिए, फिनॉल के बजाय एक चुंबकीय मोती शुद्धिकरण विधि का उपयोग किया जाता है: क्लोरोफॉर्म: आइसोअमिल अल्कोहल (पीसीआईए) निष्कर्षण विधि। इससे डीएनए निकालने का इनक्यूबेशन समय कम हो जाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह इंडेक्स एडाप्टर लिगेशन के दौरान गठित अधिकांश एडाप्टर डिमर्स को हटा देता है, जो लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर की दक्षता को प्रभावित कर सकता है।
यहां प्रस्तुत ChIP-exo प्रोटोकॉल माउस भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं से विभेदित स्तनधारी न्यूरॉन्स में सटीक प्रोटीन-डीएनए बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित है । संक्षेप में, काटा गया और क्रॉसलिंक्ड न्यूरोनल कोशिकाओं को lysed किया जाता है, ताकि क्रोमेटिन को सोनीशन के संपर्क में आने दिया जा सके, फिर ध्वनित किया जा सके ताकि उचित आकार के डीएनए टुकड़े प्राप्त किए जासकें (चित्र 1)। एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का उपयोग तब मिश्रित, घुलनशील क्रोमेटिन को ब्याज के प्रोटीन में चुनिंदा रूप से इम्यूनोप्रिपिशेट करने के लिए किया जाता है। जबकि इम्यूनोप्रिपिटेटेड डीएनए अभी भी मोतियों पर है, अंत-मरम्मत, अनुक्रमण एडाप्टर, फिल-इन रिएक्शन और 5 ‘से 3’ लैम्ब्डा एक्सोक्यूलस पाचन चरण किए जाते हैं। एक्सोक्यूलस पाचन कदम है जो ChIP-exo अपने अल्ट्रा उच्च संकल्प और उच्च संकेत से शोर अनुपात देता है । लैम्ब्डा एक्सोक्यूलेज इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड डीएनए को क्रॉसलिंकिंग साइट से कुछ बेस-जोड़े (बीपी) ट्रिम करता है, जिससे डीएनए को दूषित किया जाता है । एक्सोन्यूलेस-इलाज सीआईपी डीएनए एंटीबॉडी-कोटेड मोतियों से eluted है, प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंक उलट रहे हैं, और प्रोटीन अपमानित कर रहे हैं । डीएनए निकाला और एकल फंसे Chip डीएनए के लिए विकृत है, प्राइमर annealing और विस्तार के बाद डबल फंसे डीएनए (dsDNA) बनाने के लिए । इसके बाद, एक्सोक्यूलेस-ट्रीट किए गए सिरों के लिए एक सार्वभौमिक एडाप्टर का लिगाशन किया जाता है। परिणामस्वरूप डीएनए शुद्ध है, तो पीसीआर परिलक्षित, जेल शुद्ध, और अगली पीढ़ी अनुक्रमण के अधीन है ।
ChIP-exo प्रोटोकॉल ChIP-seq प्रोटोकॉल से अधिक लंबा है, लेकिन बहुत तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण नहीं है। किसी भी सफलतापूर्वक इम्यूनोप्रिपिटेटेड चैप डीएनए को कई अतिरिक्त एंजाइमेटिक चरणों के साथ, ChIP-exo के अधीन किया जा सकता है। सीआईपी-एक्सो के उल्लेखनीय फायदे, जैसे अल्ट्रा-हाई मैपिंग रिज़ॉल्यूशन, कम बैकग्राउंड सिग्नल, और जीनोमिक बाध्यकारी साइटों के बारे में झूठी सकारात्मक और नकारात्मक में कमी, समय लागत से पल्ला झाड़ ती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, एक्सोक्यूल्यूलेज पाचन के बाद चIP का उपयोग अल्ट्रा-हाई मैपिंग रिज़ॉल्यूशन पर स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान के लिए डीएनए पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अप्रकाशित डेटा और मूल्यवान चर्चाओं को साझा करने के लिए री प्रयोगशाला के सदस्य को धन्यवाद देते हैं । इस काम को नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (एनएसईआरसी) ग्रांट आरजीपिन-2018-06404 (एचआर) ने सपोर्ट किया ।
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
Riferimenti
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