Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)
Summary
La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.
Abstract
La identificación de interacciones específicas proteína-ADN en el genoma es importante para entender la regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se utiliza ampliamente para identificar ubicaciones de unión a todo el genoma de proteínas que unen el ADN. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por su heterogeneidad en longitud de fragmentos de ADN sonicados y ADN de fondo no específico, lo que resulta en una baja resolución cartográfica e incertidumbre en los sitios de unión al ADN. Para superar estas limitaciones, la combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) utiliza digestión exonucleasa de 5′ a 3′ para recortar el ADN inmunoprecipitado de tamaño heterogéneo al sitio de enlace cruzado proteína-ADN. El tratamiento con exonucleasa también elimina el ADN de fondo no específico. El ADN preparado por la biblioteca y digerido por exonuclease puede ser enviado para secuenciación de alto rendimiento. El método ChIP-exo permite una resolución de mapeo cercana al par base con mayor sensibilidad de detección y señal de fondo reducida. A continuación se describe un protocolo ChIP-exo optimizado para células de mamíferos y secuenciación de próxima generación.
Introduction
Las ubicaciones de las interacciones proteína-ADN proporcionan información sobre los mecanismos de regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se ha utilizado durante una década para examinar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma en las células vivas1,2. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por la heterogeneidad en la fragmentación del ADN y la contaminación de ADN no entrante que conducen a una baja resolución cartográfica, falsos positivos, llamadas perdidas y señal de fondo no específica. La combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) mejora el método ChIP-seq recortando el ADN ChIP a los puntos de enlace proteína-ADN, proporcionando una resolución cercana al par base y una señal de fondo baja3,4,5. La resolución cartográfica muy mejorada y los bajos antecedentes proporcionados por ChIP-exo permiten determinar ubicaciones precisas y completas de unión proteína-ADN en todo el genoma. ChIP-exo es capaz de revelar motivos funcionalmente distintos de unión al ADN, interacciones cooperativas entre factores de transcripción (TF) y múltiples sitios de enlace proteína-ADN en una determinada ubicación de unión genómica, no detectable por otros métodos de cartografía genómica3,4,6,7.
ChIP-exo se utilizó inicialmente en levadura en ciernes para examinar la unión de ADN específica de secuencia de los TFs, para estudiar la organización precisa del complejo de transcripción previa a la iniciación, y la estructura sub-nucleosomal de histonas individuales a través del genoma4,8,9. Desde su introducción en 20114,ChIP-exo se ha utilizado con éxito en muchos otros organismos incluyendo bacterias, ratones y células humanas7,10,11,12,13,14,15,16,17. En 2016, Rhee et al.14 utilizaron ChIP-exo en neuronas de mamíferos por primera vez para entender cómo se mantuvo la expresión génica neuronal después de la regulación descendente de la programación tf Lhx3, que forma un complejo heterodímero con otra programación TF Isl1. Este estudio demostró que en ausencia de Lhx3, Isl1 es reclutado para nuevos potenciadores neuronales unidos por Onecut1 TF para mantener la expresión génica de genes efectores neuronales. En este estudio, ChIP-exo reveló cómo múltiples TFs reconocen dinámicamente el tipo de célula y los elementos reguladores de ADN específicos de la etapa celular de una manera combinatoria a la resolución de mapeo de casi nucleótidos. Otros estudios también utilizaron el método ChIP-exo para entender la interacción entre las proteínas y el ADN en otras líneas celulares de mamíferos. Han et al.7 utilizó ChIP-exo para examinar la organización del genoma de los TFs GATA1 y TAL1 en células eritródicas de ratón utilizando ChIP-exo. Este estudio encontró que TAL1 se recluta directamente para el ADN en lugar de indirectamente a través de interacciones proteína-proteínas con GATA1 a lo largo de la diferenciación eritroide. Estudios recientes también utilizaron ChIP-exo para perfilar las ubicaciones de unión a todo el genoma de CTCF, ARN Polymerase II y marcas de histona para estudiar mecanismos epigenómicos y transcripcionales en líneas celulares humanas18,19.
Hay varias versiones del protocolo ChIP-exo disponibles3,5,20. Sin embargo, estos protocolos ChIP-exo son difíciles de seguir para las investigaciones que no están familiarizadas con la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación. Una excelente versión del protocolo ChIP-exo fue publicada con instrucciones fáciles de seguir y un video21,pero contenía muchos pasos enzimáticos que requieren una cantidad significativa de tiempo para completarse. Aquí informamos de una nueva versión del protocolo ChIP-exo que contiene pasos enzimáticos reducidos y tiempos de incubación, y explicaciones para cada paso enzimático21. Las reacciones de reparación final y relaves dA se combinan en un solo paso utilizando la enzima de preparación final. Los tiempos de incubación de los pasos de ligadura del adaptador universal y de índice se reducen de 2 h a 15 min utilizando un potenciador de ligadura. Se elimina la reacción quinasa después del paso de ligadura del adaptador de índice descrito en el protocolo ChIP-exo anterior. En su lugar, se agrega un grupo de fosfato durante la síntesis de ADN de oligo a uno de los extremos de 5′ del adaptador de índice(Tabla 1),que se utilizará para el paso de digestión lambda exonuclease. Mientras que el protocolo chip-exo anterior utilizó la digestión RecJf exonuclease para eliminar contaminantes de ADN de una sola cadena, este paso de digestión se elimina aquí porque no es crítico para la calidad de la biblioteca ChIP-exo. Además, para purificar el ADN de enlace inverso después de la elución chip, se utiliza un método de purificación de cuentas magnéticas en lugar del método de extracción de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (PCIA). Esto reduce el tiempo de incubación de la extracción de ADN. Es importante destacar que elimina la mayoría de los atenuadores de adaptador formados durante la ligadura del adaptador de índice, lo que puede afectar a la eficiencia de la PCR mediada por ligadura.
El protocolo ChIP-exo presentado aquí está optimizado para la detección de interacciones precisas proteína-ADN en neuronas de mamíferos diferenciadas de las células madre embrionarias (ES) del ratón. Brevemente, las células neuronales cosechadas y reticuladas se miman, para permitir que la cromatina esté expuesta a la sonicación, luego sonicadas para que se obtengan fragmentos de ADN de tamaño adecuado(Figura 1). Las cuentas recubiertas de anticuerpos se utilizan para inmunoprecipitar selectivamente la cromatina fragmentada y soluble a la proteína de interés. Mientras que el ADN inmunoprecipitado todavía está en las cuentas, se realizan pasos de reparación final, ligadura de adaptadores de secuenciación, reacción de relleno y 5′ a 3′ pasos de digestión exonucleasa lambda. El paso de digestión exonuclease es lo que le da a ChIP-exo su alta resolución y alta relación señal-ruido. Lambda exonuclease recorta el ADN inmunoprecipitado a unos pocos pares de bases (bp) del sitio de enlace cruzado, lo que hace que el ADN contaminante se degrade. El ADN ChIP tratado con exonucleasa se eluta de las cuentas recubiertas de anticuerpos, se invierten los enlaces cruzados proteína-ADN y se degradan las proteínas. El ADN se extrae y desnaturaliza al ADN ChIP de una sola cadena, seguido de recocido de imprimación y extensión para hacer ADN de doble cadena (dsDNA). A continuación, se realiza la ligadura de un adaptador universal a los extremos tratados con exonucleasa. El ADN resultante se purifica, luego pcr amplificado, gel purificado, y sometido a secuenciación de próxima generación.
El protocolo ChIP-exo es más largo que el protocolo ChIP-seq, pero no es muy difícil técnicamente. Cualquier ADN ChIP inmunoprecipitado con éxito puede ser sometido a ChIP-exo, con varios pasos enzimáticos adicionales. Las ventajas notables de ChIP-exo, como la resolución de mapeo ultra alta, una señal de fondo reducida y la disminución de falsos positivos y negativos, con respecto a los sitios de enlace genómico, superan el costo de tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, chip seguido de digestión exonuclease se utiliza para obtener bibliotecas de ADN para la identificación de interacciones proteína-ADN en células de mamíferos a resolución cartográfica ultra alta. Muchas variables contribuyen a la calidad del experimento ChIP-exo. Los parámetros experimentales críticos incluyen la calidad de los anticuerpos, la optimización de la sonicación y el número de ciclos LM-PCR. Estos parámetros experimentales críticos también son lo que puede limitar los experime…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al miembro del laboratorio Rhee por compartir datos inéditos y discusiones valiosas. Este trabajo fue apoyado por la subvención RGPIN-2018-06404 (H.R.) del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
Riferimenti
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