Högupplöst kartläggning av protein-DNA-interaktioner i musstamcellsbaserade nervceller med chromatinimmunprecipitation-exonukleas (ChIP-Exo)
Summary
Exakt bestämning av proteinbindande platser i genomet är viktigt för att förstå genreglering. Här beskriver vi en genomisk kartläggningsmetod som behandlar chromatin-immunoprecipitated DNA med exonuklease matsmältning (ChIP-exo) följt av hög genomströmning sekvensering. Denna metod detekterar protein-DNA interaktioner med nära bas-par mappning upplösning och hög signal-till-brus förhållandet i däggdjur nervceller.
Abstract
Identifiering av specifika protein-DNA-interaktioner på genomet är viktigt för att förstå genreglering. Kromatinimmunprecipitation i kombination med sekvensering med hög genomströmning (ChIP-seq) används ofta för att identifiera genomomfattande bindande platser för DNA-bindande proteiner. ChIP-seq-metoden begränsas dock av dess heterogenitet i längd av sonikerade DNA-fragment och icke-specifikt bakgrunds-DNA, vilket resulterar i låg kartupplösning och osäkerhet i DNA-bindande platser. För att övervinna dessa begränsningar använder kombinationen av ChIP med exonukleas matsmältning (ChIP-exo) 5′ till 3 ‘ exonuklease matsmältning för att trimma den heterogent stora immunfällda DNA till protein-DNA crosslinking webbplats. Exonukleasbehandling eliminerar också icke-specifikt bakgrunds-DNA. Det biblioteksberedda och exonukleassmälta DNA:t kan skickas för sekvensering med hög genomströmning. ChIP-exo-metoden möjliggör mappningsupplösning nära baspar med större detektionskänslighet och minskad bakgrundssignal. Nedan beskrivs ett optimerat ChIP-exo-protokoll för däggdjursceller och nästa generations sekvensering.
Introduction
Platserna för protein-DNA-interaktioner ger insikt i mekanismerna för genreglering. Kromatinimmunprecipitation i kombination med hög genomströmningssekvensering (ChIP-seq) har använts i ett decennium för att undersöka genomomfattande protein-DNA-interaktioner i levande celler1,2. ChIP-seq-metoden begränsas dock av heterogenitet i DNA-fragmentering och obunden DNA-kontaminering som leder till låg kartupplösning, falska positiva identifieringar, missade samtal och icke-specifik bakgrundssignal. Kombinationen av ChIP med exonukleas matsmältning (ChIP-exo) förbättras på ChIP-seq-metoden genom att trimma ChIP DNA till protein-DNA-korslänkningspunkterna, vilket ger nära basparupplösning och en låg bakgrundssignal3,4,5. Den kraftigt förbättrade kartupplösningen och den låga bakgrunden från ChIP-exo gör det möjligt att bestämma exakta och omfattande protein-DNA-bindningsplatser över hela genomet. ChIP-exo kan avslöja funktionellt distinkta DNA-bindande motiv, samarbetsinteraktioner mellan transkriptionsfaktorer (TF) och flera protein-DNA-korslänkningsplatser på en viss genomisk bindningsplats, som inte kan detekteras med andra genomiskakartläggningsmetoder 3,4,6,7.
ChIP-exo användes ursprungligen i spirande jäst för att undersöka den sekvensspecifika DNA-bindningen av TFs, för att studera den exakta organisationen av transkriptionskomplexet före initiering och subkärnansomstrukturen hos enskilda histoner övergenomet 4,8,9. Sedan introduktionen 20114har ChIP-exo framgångsrikt använts i många andra organismer inklusive bakterier, möss och mänskliga celler7,10,11,12,13,14,15,16,17. År 2016 använde Rhee et al.14 ChIP-exo i däggdjursneuroner för första gången för att förstå hur neuronalt genuttryck bibehölls efter nedregleringen av programmeringen TF Lhx3, som bildar ett heterodimerkomplex med en annan programmering TF Isl1. Denna studie visade att i avsaknad av Lhx3 rekryteras Isl1 till nya neuronala förstärkare bundna av Onecut1 TF för att upprätthålla genuttryck av neuronala effektorgener. I denna studie visade ChIP-exo hur flera TFs dynamiskt känner igen celltyp och cellstadiet-specifika DNA-reglerande element på ett kombinatoriskt sätt vid nära nukleotid mappning upplösning. Andra studier använde också ChIP-exo-metoden för att förstå samspelet mellan proteiner och DNA i andra däggdjurscelllinjer. Han et al.7 använde ChIP-exo för att undersöka genomomfattande organisation av GATA1 och TAL1 TFs i mus erytroida celler med ChIP-exo. Denna studie fann att TAL1 rekryteras direkt till DNA snarare än indirekt genom proteinproteininteraktioner med GATA1 under hela erytroida differentiering. Nyligen genomförda studier använde också ChIP-exo för att profilera genomomfattande bindande platser för CTCF, RNA Polymerase II och histonmärken för att studera epigenomiska och transkriptionella mekanismer i mänskligacellinjer 18,19.
Det finns flera versioner av ChIP-exo-protokollet tillgängligt3,5,20. Dessa ChIP-exo-protokoll är dock svåra att följa för forskning som inte är bekanta med nästa generations sekvensering av biblioteksförberedelser. En utmärkt version av ChIP-exo-protokollet publicerades med enkla instruktioner och en video21, men innehöll många enzymatiska steg som kräver en betydande tid att slutföra. Här rapporterar vi en ny version av ChIP-exo-protokollet som innehåller reducerade enzymatiska steg och inkubationstider och förklaringar till varje enzymatiskt steg21. Slutreparation och dA-tailing reaktioner kombineras i ett enda steg med hjälp av slutförberedande enzym. Inkubationstiderna för index- och universaladapterligeringssteg minskas från 2 timmar till 15 min med hjälp av en ligationsförstärkare. Kinasreaktionen efter indexadapterns ligatursteg som beskrivs i det tidigare ChIP-exo-protokollet tas bort. Istället tillsätts en fosfatgrupp under oligo-DNA-syntesen till en av indexadapterns 5 ändar (tabell 1), som kommer att användas för lambda exonukleas matsmältningssteget. Medan det tidigare ChIP-exo-protokollet använde RecJf exonukleas matsmältning för att eliminera enkelsträngade DNA-föroreningar, tas detta matsmältningssteg bort här eftersom det inte är avgörande för kvaliteten på ChIP-exo-biblioteket. Dessutom, för att rena omvända korslänkade DNA efter ChIP eluering, används en magnetisk pärlor rening metod i stället för fenol:kloroform:isoamyl alkohol (PCIA) extraktionsmetod. Detta minskar inkubationstiden för DNA-extraktion. Det är viktigt att den tar bort de flesta adapter dimers som bildas under indexadapter ligatur, vilket kan påverka effektiviteten hos ligation-medierad PCR.
ChIP-exo-protokollet som presenteras här är optimerat för detektion av exakta protein-DNA-interaktioner i däggdjursneuroner differentierade från mus embryonala stamceller (ES). Kort, skördade och korslänkade neuronala celler lysas, så att kromatin utsätts för ultraljudsbehandling, sedan ultraljudsbehandling så att lämpligt stora DNA-fragment erhålls (Figur 1). Antikroppsbelagda pärlor används sedan för att selektivt immunoprecipitate fragmenterade, lösliga kromatin till proteinet av intresse. Medan immunoprecipitated DNA är fortfarande på pärlor, end-repair, ligatur av sekvensering adaptrar, fyll-i reaktion och 5′ till 3 ‘ lambda exonuclease matsmältning steg utförs. Exonukleas matsmältningssteget är det som ger ChIP-exo dess ultrahög upplösning och höga signal-till-brus-förhållande. Lambda exonukleas trimmar det immunutfällda DNA:t några baspar (bp) från korslänkningsstället, vilket gör att förorenande DNA försämras. Det exonukleasbehandlade ChIP-DNA:t framkallas från de antikroppsbelagda pärlorna, protein-DNA-korslänkar vänds och proteiner bryts ned. DNA extraheras och denatureras till enkelsträngat ChIP-DNA, följt av primerglödgning och förlängning för att göra dubbelsträngat DNA (dsDNA). Därefter utförs ligatur av en universaladapter till de exonukleasbehandlade ändarna. Det resulterande DNA:t renas, sedan förstärks PCR, gel renas och utsätts för nästa generations sekvensering.
ChIP-exo-protokollet är längre än ChIP-seq-protokollet, men är inte särskilt tekniskt utmanande. Alla framgångsrikt immunoprecipitated ChIP DNA kan utsättas för ChIP-exo, med flera ytterligare enzymatiska steg. De anmärkningsvärda fördelarna med ChIP-exo, såsom ultrahög kartupplösning, en reducerad bakgrundssignal och minskade falska positiva och negativa, när det gäller genomiska bindningsställen, överväger tidskostnaden.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll används ChIP följt av exonukleas matsmältning för att erhålla DNA-bibliotek för identifiering av protein-DNA interaktioner i däggdjursceller med ultrahög kartupplösning. Många variabler bidrar till kvaliteten på ChIP-exo-experimentet. Kritiska experimentella parametrar inkluderar kvaliteten på antikroppar, optimering av ultraljudsbehandling och antalet LM-PCR cykler. Dessa kritiska experimentella parametrar är också vad som kan begränsa ChIP-exo experiment och kommer att diskuteras nedan….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmen i Rhee-laboratoriet för att ha delat opublicerade data och värdefulla diskussioner. Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) grant RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
Riferimenti
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L., A, J. e. l. t. s. c. h., Rots, M. G. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
