Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung von endokardialen und koronaren Endothelzellen aus Rattenherzen durch sequentielle Gewebeverdauung in einem Verdauungspuffer, Zellsammlung aus rezidivierenden Zentrifugenzyklen und Zellreinigung mit rattenfeindlichen CD31-Mikroperlen.

Abstract

Es wurde gezeigt, dass sich endokardiale Endothelzellen (EECs) und koronare Endothelzellen (CECs) in Herkunft, Entwicklung, Markern und Funktionen unterscheiden. Folglich spielen diese beiden Zellpopulationen eine einzigartige Rolle bei Herzerkrankungen. Aktuelle Studien mit isolierten Endothelzellen untersuchen Zellpopulationen, die sowohl aus EECs als auch aus MEL bestehen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um diese beiden Zellpopulationen für die zellspezifische Charakterisierung unabhängig voneinander zu isolieren. Nach der Entnahme der linken und rechten ventrikulären freien Wand werden Endothelzellen von der äußeren und inneren Oberfläche mit einer Verdauungspufferlösung getrennt befreit. Die sequentielle Verdauung der äußeren Oberfläche und der inneren Endokardialschicht behielt die Trennung der beiden Endothelzellpopulationen bei. Die getrennte Isolierung von EWSA und MEL wird durch die Identifizierung von Markern, die für jede Population spezifisch sind, weiter überprüft. Basierend auf zuvor veröffentlichten einzelzelligen RNA-Profilen im Mausherz ist die Genexpression Npr3, Hapln1und Cdh11 einzigartig für EECs; während Fabp4, Mgllund Cd36 Genexpression ist einzigartig für CECs. qPCR-Daten zeigten eine angereicherte Expression dieser charakteristischen Marker in ihren jeweiligen Proben, was auf eine erfolgreiche EWG- und KEK-Isolierung sowie die Aufrechterhaltung des Zellphäpnotyps hindeutet, was eine weitere zellspezifische funktionelle Analyse ermöglicht.

Introduction

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll (modifiziert von Gladka et al.¹) zur Zerlegung und anschließenden Isolierung von endokardialen Endothelzellen (EECs) und koronaren Endothelzellen (CECs) aus Rattenherzen. Die Fähigkeit, diese Zellpopulationen unabhängig zu untersuchen, würde die Erforschung zelltypspezifischer Mechanismen ermöglichen, die einer Vielzahl von Herzerkrankungen zugrunde liegen und als potenzielle therapeutische Ziele dienen könnten. Eine erfolgreiche Methode zur eigenständigen Erfassung dieser Zellpopulationen muss jedoch noch veröffentlicht werden.

Die MEL unterscheiden sich von den EWG-Ausländern in Bezug auf herkunft, Marker und Funktionen während der Herzentwicklung und Krankheit^{1,2,3,4,5,6,7}. EECs stammen von der ventralen Oberfläche des Herzmesoderms³. Sie entstehen aus Flk1⁺ Vorläuferzellen als Reaktion auf VEGF- und HIF-Signalisierung und bilden die innerste Schicht der drei diskreten Regionen des sich entwickelnden Herzens: Atrium, Ventrikel und Sinus venosus^3,6. Genetische Abstammungsverfolgung legt nahe, dass die pluripotenten Endokardenzellen des Sinus venosus Venenzellen ableiten, die zur subepikardialen Schicht³wandern. Anschließend unterscheidet sich die subepikardiale Schicht in Koronararterien und Venen, einschließlich CECs, die über der peripheren ventrikulären freien Wand^3,4verbleiben. Dieses Endokardial zu endotheliale Weg wird durch VEGFC, ELA/ APJ, und SOX17 Signalisierung^3,4,6,8,9reguliert. Das ventrikuläre Endokard leitet die weniger CECs des interventrikulären Septums durch einen unbekannten Mechanismus^{ab 3}. Anschließend wird die lokalisierte Differenzierung zwischen EECs und CECs durch Marker vorgeschlagen, die für diese beiden Zellpopulationen spezifisch sind, einschließlich Mgll, Fabp4 und Cd36-Expression in CECs oder Npr3, Cdh11 und Hapln1-Expression in EECs^3,5,10.

EECs und CECs spielen in der Herzfunktion unterschiedliche Rollen. Endokardial bis mesenchymalÜbergang, Ventilbildung, Kammerreifung, Abflusstraktregulierung und atrioventrikuläre Kanalentwicklung sind abhängig von EECs⁶. Alternativ tragen CECs zu vasomotorischem Ton und Entzündungen der Herzkranzgefäße^{bei 11}. Diese Funktionsabweichungen führen zu individuellen Rollen in der Krankheitsentwicklung^4,12. Zum Beispiel, Beweise deuten darauf hin, dass Fehlfunktionen EECs zu angeborenen Herzklappenkrankheit^führenkönnen 6 , Nichtverkomplizierung Myokard⁶, atrioventrikuläre septale Wirkung⁶, Endokardfibroelastose¹³, hypoplastische saugendes linkes Herzsyndrom¹³, ventrikuläre Hypoplasie¹³, und Herzhypertrophie¹². In ähnlicher Weise haben Studien festgestellt, dass abnorme CECs zur koronaren Herzkrankheit¹⁴ und Thrombose¹¹beitragen.

Eine erfolgreiche Isolierung von EECs und CECs ist notwendig, um umfassende Kenntnisse über diese beiden Zellpopulationen zu erlangen, die sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Umgebung genutzt werden könnten. Die Bestimmung der Wachstums- und Differenzierungsfaktoren dieser Zellpopulationen würde einen Bezugspunkt für die Differenzierung von endotheliaalen Subtypen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) bieten. Darüber hinaus ist die vollständige Identifizierung der Varianzen in der Entwicklung, Regulierung und Funktion von EECs und MEL von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der genomischen und epigenomischen Faktoren, die für zahlreiche Herzkrankheiten verantwortlich sind, zelltypspezifisch. Dieser Artikel beschreibt Die Schritte für eine erfolgreiche Sammlung von EECs und MEL unabhängig und liefert Beweise für die Trennung durch die Bewertung der Genexpressionsniveaus von zelltypspezifischen Markern.

Protocol

Alle tierischen Verfahren wurden vom Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC31608) der Stanford University genehmigt. 1. Vorbereitung von Puffern Bereiten Sie den Verdauungspuffer mit den in Tabelle 1aufgeführten Reagenzien vor. Bereiten Sie die DNase I Lagerlösung vor: Lösen Sie DNase I in RNase-freiem Wasser für eine Stammlösung von 2.000 Einheiten/ml (1 mg/ml). Aliquot und lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C. Bereiten Sie die Liberase-Lösung vor: Lösen Sie Liberase mit RNase-freiem Wasser für eine Stammlösung von 5 mg/ml. Drehen Sie es auf einer Rollenbank bei 4 °C für 30 min. Aliquot und lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C. Bereiten Sie den Sortierpuffer vor, indem Sie 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 10% Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung mit 1x Phosphat gepufferter Kochsaline (PBS) für eine Endkonzentration von 2 mM EDTA und 0,5% BSA verdünnen. 2. Herz-Sammlung HINWEIS: In diesem Protokoll wurden sechs Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 50–100 g verwendet. Es wurde kein Geschlechtsunterschied beobachtet. Euthanisieren Sie die Ratte mit CO2 und platzieren Sie sie in einer Supine-Position auf einer Sezierender Plattform. Pin die Extremitäten nach unten und sterilisieren sowohl den Bauch und Brust mit 70% Ethanol. Öffnen Sie den Bauch mit einer Schere und legen Sie eine 21 G Nadel in den Teil der hinteren Vena cava hinter dem Darm. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, ziehen Sie das Blut aus der Vene, bis die Leber heller in der Farbe erscheint und kein Blut mehr entnommen werden kann, was auf eine ausreichende Blutentnahme hindeutet. Öffnen Sie die Brust mit einer Schere vorsichtig, um eine Schädigung der Lunge und des Herzens zu vermeiden. Heben Sie den Aortabogen/Atrium mit der Zange an und schneiden Sie die Aorta, die Lungenarterie, die Lungenvenen und die Venenhöhle, um das Herz zu befreien und zu entfernen. Waschen Sie das Herz mit 50 ml kaltem 1x Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Puffer 3x, um übermäßiges Blut zu entfernen. Entfernen Sie unter einem Mikrodissektionsmikroskop die rechte ventrikuläre freie Wand in ein 5 ml-Rohr, das das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco enthält (Abbildung 1A,B). Legen Sie das Herz auf sein flacheres, hinteres Gesicht, um die linke und rechte Seite zu identifizieren. Finden Sie die Lungenarterie, die vordere der Venen und Arterien, die von der Oberseite des Herzens verzweigen und durch die Lungenarterie bis zur rechten ventrikulären Kammer schneiden. Auf dem vorderen Gesicht des Herzens, entlang des Septums schneiden, bis die Spitze zu erreichen. Schneiden Sie weiter von der Spitze die hintere Seite des Herzens entlang des Septums bis zur Lungenarterie und dem rechten ventrikulären Kammerknotenpunkt (Abbildung 1A). Ausgehend von der Lungenarterie und dem rechtsventrikulären Knotenpunkt, schneiden Sie sowohl die vordere als auch die hintere Seite des Herzens senkrecht zur vorherigen Zerlegung und weg vom Septum, bis die rechtsventrikuläre freie Wand vom Rest des Herzens befreit wird (Abbildung 1B). Entfernen Sie unter dem Mikrodissektionsmikroskop die linksventrikuläre freie Wand in ein 5 ml-Rohr mit DMEM (Abbildung 1C,D). Suchen Sie die Aorta, die von der Spitze des Herzens hinter der Lungenarterie verzweigt ist, und wiederholen Sie die in Schritt 2.5 beschriebene Methode, um die linksventrikuläre freie Wand abzuschneiden. 3. EWG-Verdauung Legen Sie sowohl rechts als auch linksventrikuläres freies Wandgewebe in eine 60 cm große Kulturschale, wobei die innere Oberfläche flach liegt (Abbildung 2).HINWEIS: Die Innenfläche ist die Innenfläche des leicht konkav geformten Ventrikels, wie in Abbildung 2A,Cdargestellt. Fügen Sie 0,5-1 ml Verdauungspuffer in die Schale, die Spitze der Pipette direkt unter das Gewebe. Fahren Sie fort, bis nur die innere Oberfläche eingetaucht ist. Inkubieren Sie die Schale in einem 5%CO2,37 °C Inkubator für 5 min. Fügen Sie ec Medium zum Kulturgericht hinzu, um die Verdauung zu stoppen.HINWEIS: Bewahren Sie die Menge des Verdauungspuffers auf EC-Medium als 1:5-Verhältnis auf. Verwenden Sie eine 1 ml Pipette, um die Innenfläche der Ventrikel mit EC-Medium zu spülen und den Abfluss durch ein 40-mm-Sieb in ein 50 ml-Sammelrohr zu übertragen (Abbildung 2E). Halten Sie die Sammlungen zur nachgelagerten Reinigung auf Eis. 4. CEC-Verdauung Schneiden Sie entlang der Außenfläche des linken Ventrikels ohne Kontamination von der inneren Schicht (Abbildung 2B,D) und legen Sie sie jeweils in ein separates 5 ml-Rohr, das 1 ml des Verdauungspuffers enthält.HINWEIS: Der linke Ventrikel kann als dickerer Ventrikel identifiziert werden, und die Außenfläche kann als Außenfläche des leicht konkaven Ventrikels bestimmt werden. Mit der Sezierschere die ventrikuläre Wand in kleine, 1 mm3 Stück zerkleinern. Inkubieren Sie das Rohr in einem 37 °C Wasserbad für ca. 15–20 min. Vortex alle 2–3 min. Pipette 4 ml EC-Medium in das 5 ml Rohr, um die Verdauung zu beenden. Übertragen Sie die Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette in ein 50 ml Rohr durch ein 40 mm Sieb (Abbildung 2E). Halten Sie die Sammlungen zur nachgelagerten Reinigung auf Eis. 5. Zellsammlung Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und aspirieren Sie dann den Überstand. Wenn das Pellet rot erscheint, setzen Sie das Pellet in 1–2 ml des 1x roten Blutkörperchens (RBC) Lysingpuffer san (Abbildung 2F).HINWEIS: Wenn keine RBCs vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 6 fort. Inkubieren Sie die Rohre in einem 37 °C Wasserbad für 5 min. Pipette 10 ml PBS in die 50 ml Rohre, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 10 min bei RT, und saugen Sie dann den Überstand an. 6. EG-Sortierung Fügen Sie den 50 ml-Rohren 90 L Sortierpuffer und 10 l Anti-CD31 PE-Antikörper hinzu. Die Rohre vortexen und dann 10 min in einem 4 °C-Kühlschrank bebrüten. 10 ml Sortierpuffer in die Rohre geben, gründlich mischen und dann bei 300 x g 10 min bei RT zentrieren. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 80 l Sortierpuffer und 20 l Anti-PE-Mikroperlen wieder auf. Wirbeln Sie die Rohre und inkubieren bei 4 °C für 15 min. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 ml Sortierpuffer in die Rohre geben, gründlich mischen und zentrieren Sie sie dann bei 300 x g für 10 min bei RT. Den Überstand ansaugen und das Pellet in 500 l Sortierpuffer wieder aufhängen. Legen Sie eine Säule mit superparamagnetischen Kugeln in einen magnetischen Separator und spülen Sie die Säule mit 3 ml Sortierpuffer. Nachdem die Spalte “Flow Stop” sind, Pipette 500 l der Zellsuspension in die Spalten und dann waschen Sie die Spalten mit Sortierpuffer. Wiederholen Sie die Wäsche 3x mit jeweils 3 ml Sortierpuffer (Abbildung 2G). Entfernen Sie die Spalten aus dem Trennzeichen, und legen Sie sie auf ein neues 15 ml-Sammelrohr. Mit einer Pipette 5 ml EC-Medium zu den Säulen hinzufügen und die Lösung durch die Verwendung eines Säulenkolbens antreiben. Zentrifugieren Sie die Sammelrohre bei 300 x g für 10 min bei RT und saugen Sie dann den Überstand an. Extrahieren Sie die RNA aus dem Zellpellet der EWG- und CEC-Proben mit einem Kit, das den Anweisungen des Herstellers folgt. Es können mindestens 500 ng RNA erhalten werden.HINWEIS: Nach der RNA-Extraktion kann die Probe bei -80 °C gelagert werden. Reverse transkribieren 500 ng RNA, um cDNA mit einem zufälligen Primer und einem Kit zu erhalten, nach den Anweisungen des Herstellers. Durchführung quantitativer PCR zur Validierung von Endokard- und Endothelpopulationen (Abbildung 2H). Primersequenzen sind in Tabelle 2aufgeführt. Fügen Sie 5 L EWG- oder CEC-cDNA (1 ng/L) in die Bohrungen einer 384 qPCR-Platte ein. Fügen Sie die EWG- oder CEC-cDNA in genügend Brunnen ein, so dass es drei Bohrungen pro Anzahl von Primern gibt. Mischen Sie 6 l des 2x qPCR SYBR-Grünpuffers mit 0,5 l pro 10-M-Primer, einschließlich Vorwärts- und Rückwärtsprimern, und fügen Sie sie in einen einzigen Brunnen ein, der jedem Kandidatengen entspricht. Versiegeln Sie die Platte mit Kunststofffolie und Zentrifuge für 1 min bei 300 x g bei RT. Legen Sie die Platte in eine qPCR-Maschine und starten Sie das Programm dann bei 95 °C für 3 min, gefolgt von 95 °C für 15 s und dann 55 °C für 60 s. Wiederholen Sie die folgenden zwei Schritte für 45 Zyklen.

Representative Results

Der Prozess der Isolierung der EWG und der KEG ist in Abbildung 2beschrieben. Die erfolgreiche Isolierung von EECs und MEL wurde durch die Bewertung des Vorhandenseins von panendotheliaalen Zellmarkern sowie der zu den beiden Subtyppopulationen unterscheidenden Marker bestimmt. Wie vorhergesagt ergab qPCR, dass die EECs im Vergleich zu den CECs im Vergleich zu den-actinCECs höhere Konzentrationen der Endokardmarker Npr3, Hapln1 und Cdh11 ausdrückten (Abbildung 3A). Ebenso drückten die CECs höhere Konzentrationen der koronaren Marker Fabp4, Mgllund Cd36 im Vergleich zu EECs (Abbildung 3B). Darüber hinaus drückten sowohl EEC als auch MEL das Pan-EC-Markergen Cdh5aus, mit etwas höheren Konzentrationen in CEC (Abbildung 3C). Abbildung 1: Diagramm der Herzsektion. (A) Erster Schnitt, um die rechte ventrikelfreie Wand vom Septum zu trennen. (B) Zweiter Schnitt gemacht, um den rechten Ventrikel vollständig zu befreien. (C) Erster Schnitt, um die linke ventrikelfreie Wand vom Septum zu trennen. (D) Zweiter Schnitt gemacht, um die linke Herzkammer vollständig zu befreien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Diagramm der Vergärungder Einrichtung der MEL und der EECs und die folgende Anordnung für die Zellsortierung. (A) Innerste freie ventrikuläre Wand und (B) äußerste ventrikuläre freie Wand wurden (C) in Denkpuffer eingetaucht bzw .( D) im Verdauungspuffer verdaut. (E) Erfassung und Filtration von Zelllösungen, gefolgt von (F) roter Blutkörperchen (RBC) Lyse und (G) magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) mit dem CD31-Antikörper. (h) Gereinigte ECs wurden zur Genexpressionsüberprüfung mit qPCR verarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: qPCR-Daten zur Überprüfung der Isolierung von MEL und EECs. (A) Die Genexpressionsniveaus der EWG-Marker Npr3, Cdh11und Hapln1 in EECs und MEL wurden durch Echtzeit-PCR quantifiziert. (B) Die Genexpressionsniveaus der KEK-Marker Mgll, Fabp4und Cd36 in EECs und CECs wurden durch Echtzeit-PCR quantifiziert. (C) Der Pan-EC-Marker Cdh5 wurde in EEC und MEL durch Echtzeit-PCR quantifiziert. (n = 3 in jeder Gruppe). Balken stehen für den Mittelwert sem. *p < 0,05, **p < 0,01 vs. EWG, ungepaarter t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Tabelle 1. Verdauungspuffer (1.5ml)   Stock Con. Final Con. Volumen Liberase TM 5 mg/ml 0,5 mg/ml 150 ul Dnase I 1 mg/ml 20 ug/ml 30 ul HEPES 1 M 10 mM 15 ul DMEM – – 1305 ul Tabelle 1: Rezept für den Verdauungspuffer. Tabelle 2. Primer-Sequenzen Genname vorwärts Rückwärts Npr3 TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA GGAATCTTCCCGCAGCTCTC Cdh11 GTGAATGGGACTGGGACTGGGG GTAATTTCTGGGGCCCTTGC Hapln1 CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG GGGCCATTTTCAGCTTGGATG Mgll CCCGGGGCCCAAAGAC GAAGATGAGGGCCTTGGGTG Fabp4 AGAAGTGGGGTTGGCTTCG ACTCTCTGACCGGATGACGA Cd36 GCAAACGACTGCAGGTCAA CCCGGTCACTTGGTTTCTGA Cdh5 CCATTGAGACAGACCCCGAC TGTGGAACGTGTGCGCTGG B-Aktin TCTGTGTGGATTGGTGGCTC CGGACTCATCGTACTCCTGC Tabelle 2: Primersequenzen

Discussion

CECs und EECs unterscheiden sich in Herkunft, Markern und Funktionen und könnten somit eine einzigartige Rolle in Entwicklung und Krankheit spielen. Bestehende Protokolle zur Endothelzellisolierung beschränken sich auf makrovaskuläre Gewebe, wodurch die Sammlung von EECs vernachlässigt wird, wodurch die Untersuchung von KEK- und EWG-spezifischen Funktionen eingeschränkt wird. Es ist von wesentlicher Bedeutung, diese beiden Populationen unabhängig voneinander zu isolieren und zu untersuchen, da dieses Wissen einen Bezug simperfür die Differenzierung von iPSCs in MEL und EECs für künftige Studien bieten und die Untersuchung dieser Zellpopulationen auf potenzielle therapeutische Ziele für verschiedene Herzkrankheiten erleichtern würde. Dieses neuartige Protokoll skizziert ein Verfahren zur Isolierung von EECs von der inneren Oberfläche und DEN MEL von der Außenfläche der ventrikulären freien Wand erwachsener Ratten.

Es ist wichtig, das Timing für jeden Schritt in diesem Protokoll sehr genau zu steuern. Da die Anzahl der EECs im Herzgewebe der Ratte sehr begrenzt ist, haben wir die Verdauungszeit der inneren Schicht des Herzens minimiert, um Zellschäden und vor allem eine CEC-Kontamination zu verhindern. Die sofortige Zugabe der EC-Medium-Lösung zur Beendigung der enzymatischen Reaktion ist ebenfalls sehr wichtig für die Aufrechterhaltung einer hohen Zelllebensfähigkeit. Ein rotes Pellet nach der Zellentnahme deutet auf das Vorhandensein einer großen Anzahl von RBCs hin. Je nach Menge der RBC-Kontamination können 1-2 ml RBC-Lysepuffer hinzugefügt werden, um die RBCs zu verschlechtern. Inkubation muss sorgfältig getimt werden, um signifikante Schäden an den Zellen zu vermeiden, und PBS wird prompt hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Mit dem aktuellen Protokoll konnten wir 10⁵ EECs aus sechs Rattenherzen isolieren. Diese Zellen könnten zur weiteren Ausdehnung und Charakterisierung auf eine Zellkulturschale gesät werden.

Bei der Vorbereitung des Gewebes für die kostenlose Wandsammlung wurde das Herz mit HBSS gewaschen, um den Großteil der verbleibenden RBCs zu entfernen. HBSS ist aufgrund seines klaren Aussehens das empfohlene Medium, das die Visualisierung von Blutzellen ermöglicht, im Gegensatz zu DMED, das Phenolrot enthält. Die Zusammensetzung des Verdauungspuffers gewährleistet eine ausreichende Befreiung der Endothelzellen, Wenn das Liberase-Verdauungsenzym das Gewebe der exponierten Zellen abstreift, eliminiert DNase I DNA aus den abgestorbenen Zellen, um die Zellablösung zu fördern, die durch die Klebstoffqualität der DNA gehemmt werden kann, gleicht der HEPES-Puffer den pH-Wert aus, und DMEM ist ein modifiziertes Basalmedium mit einer höheren Konzentration an Aminosäuren und Vitaminen für eine bessere Zellerhaltung und enthält das Kalzium, das notwendig ist, um die Liberase zu aktivieren.

Nach der einzelzelligen RNA-Sequenzierung (scRNA-seq), die sowohl aus dem menschlichen^15- als auch aus dem Mausherz¹⁰gewonnen wurde, wurden mehrere Marker berichtet, die bestimmten EC-Populationen zugeschrieben wurden. Wir wählten einige der am meisten angereicherten Gene aus, um die Reinheit isolierter EECs (z. B. Npr3, Cdh11und Hapln1) und EECs (d. h. Mgll, Fabp4und Cd36) zu untersuchen. Die Marker n β-Actin, Npr3, Cdh11und Hapln1 zeigten eine erhöhte Expression in EECs im Vergleich zu CECs. In ähnlicher Weise war die Expression von Mgll-, Fabp4-und Cd36-Markern in DEN MEL im Vergleich zu EECs größer. Die eindeutig ausgedrückten Marker für jede Probe entsprechen den für EECs bzw. MEL charakteristischen Markern, was auf eine erfolgreiche Isolierung hindeutet.

Das aktuelle Protokoll kann jedoch eine Kreuzkontamination zwischen den beiden EG-Populationen während der Isolierung nicht ausschließen, selbst bei sorgfältig kontrollierten sequentiellen Verdauungen. Daher können einige Zelloberflächenmarker zur weiteren Reinigung eingesetzt werden. Beispielsweise beschriftet NPR3 im Allgemeinen das Endokard¹⁰, während APJ einen Großteil der CECs¹⁶nachverfolgen kann. Da diese beiden Marker auf der Zelloberfläche exprimiert werden, könnten sie für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und Antikörper verwendet werden, um unterschiedliche EC-Populationen weiter zu reinigen. Darüber hinaus können menschliche¹⁵ und Maus¹⁰ Herz scRNA-seq die Anreicherung von Npr3 in EECs bestätigen, und Cd36 kann potenziell für die CEC-Reinigung verwendet werden.

Abschließend skizziert das vorgelegte Protokoll die unabhängige Isolierung von EWSA und MEL vom Rattenherz. Die umfassende Identifizierung zellulärer Eigenschaften, die durch Zellisolation ermöglicht wird, kann für signifikante nachgelagerte Anwendungen genutzt werden.

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080	1M
15ml Tubes	Eppendorf	0030122151
50ml Tubes	Nunc	339652
5ml Tubes	Eppendorf	30119401
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Anti-CD31 PE	Miltenyi Biotec	130-115-505
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA)	Miltenyi Biotec	130-091-376	10%
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-rad	1855485	For qPCR
DNAse I	Worthington	LK 003172	1 mg/mL in water
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)	Lonza	CC-3162	EC Medium
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15575020	0.5 M
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1	Gibco	14025092
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-rad	HSP3805	For qPCR
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
Liberase TM	Sigma Aldrich	5401119001	5 mg/mL
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401	For EC isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-302	For EC isolation
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-rad	MSB1001	For qPCR
Narrow Pattern Forceps	F.S.T	11002-12	For heart harvest
Nylon Sterile Strainer	Falcon	352340	40 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1	Gibco	1001023
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	For qPCR
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1050	For RNA extraction
S&T Forceps – SuperGrip Tips	F.S.T	00632-11	For heart harvest
Strabismus Scissors – Tungsten Carbide	F.S.T	14574-11	For heart harvest
Vannas Spring Scissors – Microserrated	F.S.T	15007-08	For heart harvest