Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Summary

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Abstract

Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari rilasciate praticamente da tutte le cellule e secrete in tutti i fluidi biologici. Sono stati sviluppati molti metodi per l'isolamento di queste vescicole, tra cui l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Tuttavia, non tutti sono adatti per la purificazione e la caratterizzazione di esosomi su larga scala. Qui è delineato un protocollo per stabilire colture di fibroblasti primari isolati da muscoli scheletrici di topo adulto, seguito dalla purificazione e caratterizzazione degli esosomi dai terreni di coltura di queste cellule. Il metodo si basa sull'uso di fasi di centrifugazione sequenziale seguite da gradienti di densità del saccarosio. La purezza dei preparati esosomiali viene quindi convalidata mediante analisi western blot utilizzando una batteria di marcatori canonici (ad esempio, Alix, CD9 e CD81). Il protocollo descrive come isolare e concentrare gli esosomi bioattivi per la microscopia elettronica, la spettrometria di massa e gli esperimenti di uptake per studi funzionali. Può essere facilmente scalato verso l'alto o verso il basso e adattato per l'isolamento degli esosomi da diversi tipi di cellule, tessuti e fluidi biologici.

Introduction

Gli esosomi sono vescicole extracellulari eterogenee di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm. Sono attori chiave affermati nei processi fisiologici e patologici, data la loro distribuzione ubiquitaria nei tessuti e negli organi ^1,2. Gli esosomi trasportano un carico complesso di proteine, lipidi, tipi di DNA e tipi di RNA, che variano a seconda del tipo di cellule da cui derivano ^1,2,3. Gli esosomi sono arricchiti in proteine che hanno funzioni diverse (ad esempio, le tetraspanine, tra cui CD9 e CD63) sono responsabili....

Protocol

Tutte le procedure nei topi sono state eseguite secondo i protocolli sugli animali approvati dal St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee e dalle linee guida del National Institutes of Health.

1. Preparazione delle soluzioni e dei terreni

1. Preparare la soluzione di digestione mescolando 15,4 mL di PBS con 2,5 mL di 20 mg/mL di collagenasi P (concentrazione finale di 5 mg/mL), 2 mL di dispasi II 11 U/mL (concentrazione finale di 1,2 U/mL) e 100 μL di CaCl₂ 1,0 M (concentrazione finale di 5 mM).
2. Preparare 500 mL di terreno fibroblastico primario (DMEM completo) mescolando ....

Results

Questo protocollo è adatto per la purificazione di esosomi da grandi volumi di terreno condizionato in modo economico. La procedura è altamente riproducibile e coerente. La Figura 1 mostra l'immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) degli esosomi purificati dal terreno di coltura dei fibroblasti primari di topo. La Figura 2 mostra il pattern di espressione proteica dei marcatori esosomiali canonici e l'assenza di contaminanti proteici citosolici (.......

Discussion

Un passo fondamentale per il successo dell'isolamento degli esosomi dai terreni di coltura, come delineato in questo protocollo, è la corretta costituzione e mantenimento di colture primarie di fibroblasti di topo dal muscolo scheletrico adulto. Queste colture devono essere mantenute a un basso livello di ossigeno per garantire condizioni simili a quelle fisiologiche (il livello di O₂ nel muscolo scheletrico è ~2,5%)¹⁵. I fibroblasti primari cambiano caratteristiche se passati in coltur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastre da 10 cm	Midwest Scientific, TPP	TP93100
piastre da 15 cm	BCA TP93150		Midwest
	Scientific Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
Albumina sierica bovina Frazione V	Roche	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Centrifuga 5430R con rotori FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP sistema di imaging	BioRad	12003154
Collagenasi P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter con elettrodi a piastre	BioRad
Criterion TGX gel proteico senza macchie	BioRad	5678034	10% 18 pozzetti, midi-gel
Cella per elettroforesi verticale (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	proteasi neutra, grado II
Ditiotreitolo	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
Dulbecco' s Modifica Aquile Medie Corning		15-013-CV
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato	Corning	21-031-CV
Etanolo 200 proof	Pharmco di Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL provette da centrifuga coniche	Corning	352070
Siero fetale bovino	Gibco	10437-028
Lettore di micropiastre multimodale Fluostar Omega	BMG Labtech
GlutaMAX integratore	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P Membrane di trasferimento	Millipore	IPVH00010
tampone per campioni Laemmli (4x)	BioRad	1610747
Soluzione di acetato di magnesio	Sigma	63052-100ml
Latte in polvere scremato	Incubatore LabScientific	M-0842
O2/CO2	Sanyo	MC0-18M
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10.000 U/ml
Provette per microcentrifuga Premium	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1,7 mL
Bisturi	monouso protettiFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
Tampone di corsa	BioRad	1610732
Cloruro di sodio	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup Sistema di filtrazione sottovuoto sterile a sgancio rapido-GP	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
Filtro cellulare sterile (70 mm)	Fisher Scientific, marchio	Fisher22-363-548
Saccarosio	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
Tubi in polipropilene a parete sottile	Beckman Coulter	326823
Tampone di trasferimento	BioRad	16110734
Acido tricloroacetico	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Soluzione Triton-X100	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	No phenol red
Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-centrifuga Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Provetta ultra trasparente (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Tubi ultratrasparenti (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
Bagnomaria Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220