कंकाल की मांसपेशी फाइब्रोब्लास्ट से एक्सोसोम का अलगाव और लक्षण वर्णन
Summary
यह प्रोटोकॉल 1) वयस्क माउस गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संस्कृति को दर्शाता है और साथ ही 2) सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट के साथ संयुक्त अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करके एक्सोसोम का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन करता है, जिसके बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण होता है।
Abstract
एक्सोसोम लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा जारी किए गए छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं हैं और सभी जैविक तरल पदार्थों में स्रावित होती हैं। इन पुटिकाओं के अलगाव के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी शामिल हैं। हालांकि, सभी बड़े पैमाने पर एक्सोसोम शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यहां उल्लिखित वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, इसके बाद इन कोशिकाओं के संस्कृति मीडिया से एक्सोसोम का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन किया गया है। विधि सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट के बाद अनुक्रमिक सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के उपयोग पर आधारित है। एक्सोसोमल तैयारी की शुद्धता को तब कैननिकल मार्करों (यानी, एलिक्स, सीडी 9 और सीडी 81) की बैटरी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मान्य किया जाता है। प्रोटोकॉल बताता है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और कार्यात्मक अध्ययन के लिए अपटेक प्रयोगों के लिए बायोएक्टिव एक्सोसोम को कैसे अलग और केंद्रित किया जाए। इसे आसानी से ऊपर या नीचे किया जा सकता है और विभिन्न सेल प्रकारों, ऊतकों और जैविक तरल पदार्थों से एक्सोसोम अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
एक्सोसोम विषम बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं हैं जो 30-150 एनएम के आकार में होती हैं। वे शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में प्रमुख खिलाड़ी स्थापित हैं, ऊतकों और अंगों में उनके सर्वव्यापी वितरण को देखते हुए 1,2. एक्सोसोम में प्रोटीन, लिपिड, डीएनए प्रकार और आरएनए प्रकार ों का एक जटिल कार्गो होता है, जो कोशिकाओं के प्रकार के अनुसार भिन्न होता है जिससे वे 1,2,3 प्राप्त होते हैं। एक्सोसोम प्रोटीन में समृद्ध होते हैं जिनके अलग-अलग कार्य होते हैं (यानी, सीडी 9 और सीडी 63 सहित टेट्रास्पैनिन) संलयन घटनाओं के लिए जिम्मेदार होते हैं। उदाहरण के लिए, हीट शॉक प्रोटीन एचएसपी 70 और एचएसपी 90 एंटीजन बाइंडिंग और प्रस्तुति में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एलिक्स, टीएसजी 101, और फ्लोटिलिन एक्सोसोम बायोजेनेसिस और रिलीज में भाग लेते हैं और व्यापक रूप से इन नैनोपुटिकाओं 2,3,4 के मार्कर के रूप में उपयोग किए जाते हैं।
एक्सोसोम में विभिन्न प्रकार के आरएनए (यानी, माइक्रोआरएनए, लॉन्ग नॉनकोडिंग आरएनए, राइबोसोमल आरएनए) भी होते हैं जिन्हें प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है, जहां वे डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग3 को प्रभावित करते हैं। एकल इकाई झिल्ली से घिरा होने के कारण, एक्सोसोम बायोएक्टिविटी न केवल प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के कार्गो पर निर्भर करती है, बल्कि सीमित झिल्ली1 के लिपिड घटकों पर भी निर्भर करती है। एक्सोसोमल झिल्ली फॉस्फेटिडिलसेरिन, फॉस्फेटिडिक एसिड, कोलेस्ट्रॉल, स्फिंगोमाइलिन, एराकिडोनिक एसिड और अन्य फैटी एसिड में समृद्ध होती है, जिनमें से सभी एक्सोसोम स्थिरता और झिल्ली टोपोलॉजी 2,3 को प्रभावित कर सकते हैं। कार्गो और लिपिड व्यवस्था के परिणामस्वरूप, एक्सोसोम कोशिकाओं को प्राप्त करने में सिग्नलिंग मार्ग शुरू करते हैं और सामान्य ऊतक शरीर विज्ञान 1,2,4,5 के रखरखाव में भाग लेते हैं। कुछ रोग स्थितियों (यानी, न्यूरोडीजेनेरेशन, फाइब्रोसिस और कैंसर) के तहत, उन्हें पैथोलॉजिकल उत्तेजनाओं 4,6,7,8,9,10,11 को ट्रिगर और प्रचारित करने के लिए दिखाया गया है।
पड़ोसी या दूर की साइटों पर संकेतों का प्रसार करने की उनकी क्षमता के कारण, एक्सोसोम रोग की स्थिति के निदान या पूर्वानुमान के लिए मूल्यवान बायोमार्कर बन गए हैं। इसके अलावा, एक्सोसोम का उपयोग चिकित्सीय यौगिकों 2,12 के वाहनों के रूप में प्रयोगात्मक रूप से किया गया है। क्लिनिक में इन नैनोपुटिकाओं का संभावित अनुप्रयोग अधिकतम उपज, शुद्धता और प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए अलगाव विधि को तेजी से महत्वपूर्ण बनाता है। एक्सोसोम के अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित और कार्यान्वित किया गया है। आम तौर पर, एक्सोसोम को डिफरेंशियल सेंट्रीफ्यूजेशन, साइज एक्सक्लूजन क्रोमैटोग्राफी और इम्यून कैप्चर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके) द्वारा वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया या शरीर के तरल पदार्थ से अलग किया जा सकता है। प्रत्येक दृष्टिकोण के अद्वितीय फायदे और नुकसान हैं जिनकी चर्चा पहले 1,2,13,14 की गई है।
उल्लिखित प्रोटोकॉल 1) वयस्क माउस गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संस्कृति पर केंद्रित है और 2) इन कोशिकाओं द्वारा संस्कृति माध्यम में जारी एक्सोसोम का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन। कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट से एक्सोसोम के अलगाव के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल की वर्तमान में कमी है। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट बड़ी मात्रा में एक्सोसोम का स्राव नहीं करते हैं, जिससे अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण हो जाती है। यह प्रोटोकॉल उनकी रूपात्मक अखंडता और कार्यात्मक गतिविधि को बनाए रखते हुए बड़ी संस्कृति की मात्रा से बड़ी मात्रा में शुद्ध एक्सोसोम के शुद्धिकरण का वर्णन करता है। वातानुकूलित माध्यम से प्राप्त शुद्ध एक्सोसोम का उपयोग प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में विशिष्ट सिग्नलिंग मार्गों को प्रेरित करने के लिए इन विट्रो अपटेक प्रयोगों में सफलतापूर्वक किया गया है। उनका उपयोग कई जैविक नमूनों से एक्सोसोमल कार्गो के तुलनात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए भी किया गयाहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति मीडिया से एक्सोसोम के सफल अलगाव के लिए एक महत्वपूर्ण कदम, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित है, वयस्क कंकाल की मांसपेशियों से प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की उचित स्थापना और रखर…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एलेसेंड्रा डी’अज़ो जेनेटिक्स और जीन थेरेपी में ज्वैलर्स फॉर चिल्ड्रन (जेएफसी) संपन्न कुर्सी रखती हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान R01GM104981, RO1DK095169 और CA021764, मेम्फिस के असीसी फाउंडेशन और अमेरिकी लेबनानी सीरियाई एसोसिएटेड चैरिटीज द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Riferimenti
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- . Muscle Dissection in mouse Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016)
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
