골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)
Summary
이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
엑소좀은 거의 모든 세포에서 방출되고 모든 생체액에서 분비되는 작은 세포외 소포체입니다. 이러한 소포를 분리하기 위해 초원심분리, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 많은 방법이 개발되었습니다. 그러나 모든 엑소좀이 대규모 엑소좀 정제 및 특성화에 적합한 것은 아닙니다. 여기에는 성체 쥐 골격근에서 분리한 일차 섬유아세포의 배양을 확립한 후 이들 세포의 배양 배지에서 엑소좀을 정제하고 특성 분석하기 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 이 방법은 순차적 원심분리 단계 후 자당 밀도 구배를 사용하는 것을 기반으로 합니다. 그런 다음 엑소좀 제제의 순도는 표준 마커(예: Alix, CD9 및 CD81)를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검증됩니다. 이 프로토콜은 전자 현미경, 질량 분석법 및 기능 연구를 위한 흡수 실험을 위해 생체 활성 엑소좀을 분리하고 농축하는 방법을 설명합니다. 쉽게 확장 또는 축소할 수 있으며 다양한 세포 유형, 조직 및 생물학적 체액에서 엑소좀 분리에 적용할 수 있습니다.
Introduction
엑소좀은 크기가 30–150nm인 이질적인 세포외 소포체입니다. 그들은 생리학 및 병리학적 과정에서 확립된 핵심 플레이어이며, 조직과 장기에 유비쿼터스 분포를 가지고 있습니다 1,2. 엑소좀은 단백질, 지질, DNA 유형 및 RNA 유형의 복잡한 화물을 운반하며, 이는 파생된 세포의 유형에 따라 다릅니다 1,2,3. 엑소좀은 서로 다른 기능을 하는 단백질(즉, CD9 및 CD63을 포함한 테트라스파닌)이 풍부하여 융합 현상을 담당합니다. 예를 들어, 열 충격 단백질 HSP70 및 HSP90은 항원 결합 및 제시에 관여합니다. 또한 Alix, Tsg101 및 flotillin은 엑소좀 생물 발생 및 방출에 관여하며 이러한 나노 소포 2,3,4의 마커로 널리 사용됩니다.
엑소좀은 또한 수용 세포로 전달될 수 있는 다양한 RNA(즉, microRNA, long noncoding RNA, ribosomal RNA)를 포함하며, 이는 다운스트림 신호전달에 영향을 미칩니다3. 엑소좀 생리활성은 단일 단위막으로 둘러싸여 있기 때문에 단백질과 핵산의 화물뿐만 아니라 제한막의 지질 성분에도 의존한다1. 엑소좀 막에는 포스파티딜세린, 포스파티드산, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 아라키돈산 및 기타 지방산이 풍부하며, 이 모든 것이 엑소좀 안정성과 막 토폴로지에 영향을 미칠 수 있습니다 2,3. 화물과 지질 배열의 결과로 엑소좀은 수용 세포에서 신호 전달 경로를 시작하고 정상 조직 생리의 유지에 관여합니다 1,2,4,5. 특정 병리학적 조건(예: 신경 퇴행, 섬유증 및 암)에서 병리학적 자극을 유발하고 전파하는 것으로 나타났습니다 4,6,7,8,9,10,11.
엑소좀은 인접 부위나 먼 부위에 신호를 전파할 수 있는 능력으로 인해 질병 상태의 진단 또는 예후에 중요한 바이오마커가 되었습니다. 또한 엑소좀은 치료용 화합물 2,12의 매개체로 실험적으로 사용되었습니다. 클리닉에서 이러한 나노 소포의 잠재적 인 적용은 최대 수율, 순도 및 재현성을 달성하기 위해 분리 방법을 점점 더 중요하게 만듭니다. 엑소좀을 분리하기 위한 다양한 기술이 개발되고 구현되었습니다. 일반적으로 엑소좀은 차등 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 면역 포획(시판 키트 사용)을 통해 조건화된 세포 배양 배지 또는 체액에서 분리할 수 있습니다. 각 접근 방식에는 이전에 논의된 고유한 장점과 단점이있습니다 1,2,13,14.
개요된 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하며, 2) 이러한 세포에 의해 배양 배지로 방출되는 엑소좀의 정제 및 특성 분석에 중점을 둡니다. 기능성 연구를 위해 원발성 섬유아세포에서 엑소좀을 분리하기 위한 잘 확립된 프로토콜은 현재 부족합니다. 일차 섬유아세포는 많은 양의 엑소좀을 분비하지 않기 때문에 분리 및 정제 과정이 까다롭습니다. 이 프로토콜은 형태학적 무결성과 기능적 활성을 유지하면서 대량의 배양물에서 다량의 순수 엑소좀을 정제하는 방법을 설명합니다. 조건화된 배지에서 얻은 정제된 엑소좀은 in vitro 흡수 실험에서 성공적으로 사용되어 수용 세포에서 특정 신호 전달 경로를 유도했습니다. 또한 여러 생물학적 샘플에서 추출한 엑소좀 화물의 비교 단백질체 분석에도 사용되어 왔다4.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 설명된 바와 같이 배양 배지에서 엑소좀을 성공적으로 분리하기 위한 중요한 단계는 성체 골격근에서 1차 마우스 섬유아세포 배양을 적절하게 확립하고 유지하는 것입니다. 이러한 배양은 생리학적으로 유사한 조건(골격근의 O2 수준은 ~2.5%)을 보장하기 위해 낮은 산소 수준으로 유지되어야 합니다15. 원발성 섬유아세포는 배양에 너무 많이 통과되면 형질?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
알레산드라 다조(Alessandra d’Azzo)는 유전학 및 유전자 치료 분야의 JFC(Jewelers for Children) 기부 의장을 맡고 있습니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01GM104981, RO1DK095169, CA021764, 멤피스의 아시시 재단, 미국 레바논 시리아 연합 자선 단체의 일부 지원을 받았습니다.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Riferimenti
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