Isolering og karakterisering av eksosomer fra skjelettmuskulaturfibroblaster
Summary
Denne protokollen illustrerer 1) isolering og kultur av primære fibroblaster fra den voksne musen gastrocnemius muskel samt 2) rensing og karakterisering av eksosomer ved hjelp av en differensial ultrasentrifugering metode kombinert med sukrose tetthet gradienter etterfulgt av western blot analyser.
Abstract
Eksosomer er små ekstracellulære vesikler frigjort av nesten alle celler og utskilt i alle biologiske væsker. Mange metoder er utviklet for isolering av disse vesiklene, inkludert ultrasentrifugering, ultrafiltrering og størrelsesekskluderingskromatografi. Imidlertid er ikke alle egnet for storskala eksosomrensing og karakterisering. Skissert her er en protokoll for å etablere kulturer av primære fibroblaster isolert fra voksne musskjelettmuskler, etterfulgt av rensing og karakterisering av eksosomer fra kulturmediene til disse cellene. Metoden er basert på bruk av sekvensielle sentrifugeringstrinn etterfulgt av sukrosetetthetsgradienter. Renheten til de eksosomale preparatene valideres deretter ved hjelp av western blot-analyser ved hjelp av et batteri av kanoniske markører (dvs. Alix, CD9 og CD81). Protokollen beskriver hvordan man isolerer og konsentrerer bioaktive eksosomer for elektronmikroskopi, massespektrometri og opptakseksperimenter for funksjonelle studier. Det kan enkelt skaleres opp eller ned og tilpasses for eksosomisolering fra forskjellige celletyper, vev og biologiske væsker.
Introduction
Exosomer er heterogene ekstracellulære vesikler som varierer i størrelse fra 30-150 nm. De er etablerte nøkkelspillere i fysiologiske og patologiske prosesser, gitt deres allestedsnærværende distribusjon i vev og organer 1,2. Eksosomer bærer en kompleks last av proteiner, lipider, DNA-typer og RNA-typer, som varierer i henhold til typen celler som de er avledet fra 1,2,3. Eksosomer er beriket i proteiner som har forskjellige funksjoner (dvs. tetraspaniner, inkludert CD9 og CD63) er ansvarlige for fusjonshendelser. For eksempel er varmesjokkproteiner HSP70 og HSP90 involvert i antigenbinding og presentasjon. I tillegg deltar Alix, Tsg101 og flotillin i eksosombiogenese og frigjøring og er mye brukt som markører for disse nanovesiklene 2,3,4.
Eksosomer inneholder også en rekke RNA (dvs. mikroRNA, lange ikke-kodende RNAer, ribosomale RNAer) som kan overføres til mottakerceller, hvor de påvirker nedstrøms signalering3. Å være omsluttet av en enkelt enhetsmembran, avhenger eksosombioaktivitet ikke bare av lasten av proteiner og nukleinsyrer, men også av lipidkomponenter i begrensningsmembranen1. Eksosomale membraner er beriket i fosfatidylserin, fosfatidsyre, kolesterol, sfingomyelin, arakidonsyre og andre fettsyrer, som alle kan påvirke eksosomstabilitet og membrantopologi 2,3. Som et resultat av last- og lipidarrangementet initierer eksosomer signalveier i mottaksceller og deltar i vedlikehold av normal vevsfysiologi 1,2,4,5. Under visse patologiske forhold (dvs. nevrodegenerasjon, fibrose og kreft) har de vist seg å utløse og forplante patologiske stimuli 4,6,7,8,9,10,11.
På grunn av deres evne til å forplante signaler til nærliggende eller fjerne steder, har eksosomer blitt verdifulle biomarkører for diagnose eller prognose av sykdomsforhold. I tillegg har eksosomer blitt brukt eksperimentelt som kjøretøy av terapeutiske forbindelser 2,12. Den potensielle anvendelsen av disse nanovesiklene i klinikken gjør isolasjonsmetoden stadig viktigere for å oppnå maksimal renhet, renhet og reproduserbarhet. Ulike teknikker for isolering av eksosomer er utviklet og implementert. Generelt kan eksosomer isoleres fra betingede cellekulturmedier eller kroppsvæsker ved differensiell sentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi og immunopptak (ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett). Hver tilnærming har unike fordeler og ulemper som har blitt diskutert tidligere 1,2,13,14.
Den skisserte protokollen fokuserer på 1) isolasjon og kultur av primære fibroblaster fra voksen mus gastrocnemius muskel og 2) rensing og karakterisering av eksosomer frigjort i kulturmediet av disse cellene. En veletablert protokoll for isolering av eksosomer fra primære fibroblaster for funksjonelle studier mangler for tiden. Primære fibroblaster utskiller ikke store mengder eksosomer, noe som gjør isolasjons- og renseprosessen utfordrende. Denne protokollen beskriver rensing av store mengder rene eksosomer fra store kulturvolumer samtidig som deres morfologiske integritet og funksjonelle aktivitet opprettholdes. Rensede eksosomer oppnådd fra betinget medium har blitt brukt med hell i in vitro opptakseksperimenter for å indusere spesifikke signalveier i mottakerceller. De har også blitt brukt til komparative proteomiske analyser av eksosomale laster fra flere biologiske prøver4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk skritt for vellykket isolering av eksosomer fra kulturmediene, som beskrevet i denne protokollen, er riktig etablering og vedlikehold av primære musfibroblastkulturer fra voksen skjelettmus. Disse kulturene må opprettholdes på et lavt oksygennivå for å sikre fysiologisk-lignende forhold (O2-nivå i skjelettmuskulatur er ~ 2,5%)15. Primære fibroblaster vil endre egenskaper når de passerer i kultur for mange ganger. Derfor er et lavt passasjetall avgjørende for ideelt e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alessandra d’Azzo har Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair i genetikk og genterapi. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH-tilskudd R01GM104981, RO1DK095169 og CA021764, Assisi Foundation of Memphis, og American Libanese Syrian Associated Charities.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Riferimenti
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- . Muscle Dissection in mouse Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016)
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
