Выделение и характеристика экзосом фибробластов скелетных мышц
Summary
Этот протокол иллюстрирует: 1) выделение и культивирование первичных фибробластов из икроножной мышцы взрослой мыши, а также 2) очистку и характеристику экзосом с использованием метода дифференциального ультрацентрифугирования в сочетании с градиентами плотности сахарозы с последующим вестерн-блоттинг-анализом.
Abstract
Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы, выделяемые практически всеми клетками и секретируемые во всех биологических жидкостях. Для выделения этих везикул было разработано множество методов, включая ультрацентрифугирование, ультрафильтрацию и эксклюзионную хроматографию. Однако не все из них подходят для крупномасштабной очистки и характеризации экзосом. Изложен протокол создания культур первичных фибробластов, выделенных из скелетных мышц взрослых мышей, с последующей очисткой и характеристикой экзосом из питательных сред этих клеток. Метод основан на использовании последовательных стадий центрифугирования с последующими градиентами плотности сахарозы. Чистота экзосомальных препаратов затем подтверждается вестерн-блоттинг-анализом с использованием батареи канонических маркеров (например, Alix, CD9 и CD81). Протокол описывает, как выделять и концентрировать биоактивные экзосомы для электронной микроскопии, масс-спектрометрии и экспериментов по поглощению для функциональных исследований. Его можно легко увеличить или уменьшить и адаптировать для выделения экзосом из различных типов клеток, тканей и биологических жидкостей.
Introduction
Экзосомы представляют собой гетерогенные внеклеточные везикулы размером от 30 до 150 нм. Они являются установленными ключевыми игроками в физиологических и патологических процессах, учитывая их повсеместное распространение в тканях и органах 1,2. Экзосомы несут сложный груз белков, липидов, типов ДНК и РНК, которые различаются в зависимости от типа клеток, из которых они получены. Экзосомы обогащены белками, которые выполняют различные функции (например, тетраспанины, включая CD9 и CD63), ответственные за события слияния. Например, белки теплового шока HSP70 и HSP90 участвуют в связывании и презентации антигена. Кроме того, Alix, Tsg101 и флотиллин участвуют в биогенезе и высвобождении экзосом и широко используются в качестве маркеров этих нановезикул 2,3,4.
Экзосомы также содержат различные РНК (т.е. микроРНК, длинные некодирующие РНК, рибосомные РНК), которые могут передаваться клеткам-реципиентам, где они влияют на последующую передачу сигналов. Биоактивность экзосомы, заключенной в единую единую мембрану, зависит не только от груза белков и нуклеиновых кислот, но и от липидных компонентов лимитирующей мембраны1. Экзосомальные мембраны обогащены фосфатидилсерином, фосфатидной кислотой, холестерином, сфингомиелином, арахидоновой кислотой и другими жирными кислотами, которые могут влиять на стабильность экзосом и топологию мембраны 2,3. В результате карго- и липидного расположения экзосомы инициируют сигнальные пути в принимающих клетках и участвуют в поддержании нормальной физиологии тканей 1,2,4,5. Было показано, что при определенных патологических состояниях (например, нейродегенерации, фиброзе и раке) они запускают и распространяют патологические стимулы 4,6,7,8,9,10,11.
Благодаря своей способности распространять сигналы в соседние или отдаленные участки, экзосомы стали ценными биомаркерами для диагностики или прогнозирования заболеваний. Кроме того, экзосомы были экспериментально использованы в качестве носителей терапевтических соединений 2,12. Потенциальное применение этих нановезикул в клинике делает метод выделения все более важным для достижения максимального выхода, чистоты и воспроизводимости. Разработаны и внедрены различные методики выделения экзосом. Как правило, экзосомы могут быть выделены из кондиционированных клеточных культуральных сред или жидкостей организма с помощью дифференциального центрифугирования, эксклюзионной хроматографии и иммунного захвата (с использованием коммерчески доступных наборов). Каждый подход имеет уникальные преимущества и недостатки, которые обсуждались ранее 1,2,13,14.
Изложенный протокол фокусируется на 1) выделении и культивировании первичных фибробластов из икроножной мышцы взрослой мыши и 2) очистке и характеристике экзосом, высвобождаемых в питательную среду этими клетками. Устоявшийся протокол выделения экзосом из первичных фибробластов для функциональных исследований в настоящее время отсутствует. Первичные фибробласты не секретируют большое количество экзосом, что затрудняет процесс изоляции и очистки. Данный протокол описывает очистку больших количеств чистых экзосом от больших объемов культуры с сохранением их морфологической целостности и функциональной активности. Очищенные экзосомы, полученные из кондиционированной среды, были успешно использованы в экспериментах по захвату in vitro для индуцирования специфических сигнальных путей в клетках-реципиентах. Они также использовались для сравнительного протеомного анализа экзосомальных грузов из нескольких биологических образцов4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшим шагом для успешного выделения экзосом из питательной среды, как указано в этом протоколе, является надлежащее установление и поддержание первичных культур фибробластов мышей из скелетных мышц взрослого человека. Эти культуры необходимо поддерживать при низком уровне кисло…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Алессандра д’Аццо возглавляет кафедру генетики и генной терапии Фонда «Ювелиры для детей» (JFC). Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01GM104981, RO1DK095169 и CA021764, Фондом Ассизи в Мемфисе и Американо-ливанско-сирийской ассоциированной благотворительной организацией.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Riferimenti
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
- Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
- van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
- Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
- Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
- Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
- Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
- Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
- . Muscle Dissection in mouse Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016)
- Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
- Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
- Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).
