Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético
Summary
Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.
Abstract
Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares liberadas por prácticamente todas las células y secretadas en todos los fluidos biológicos. Se han desarrollado muchos métodos para el aislamiento de estas vesículas, incluida la ultracentrifugación, la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión por tamaño. Sin embargo, no todos son adecuados para la purificación y caracterización de exosomas a gran escala. A continuación se describe un protocolo para establecer cultivos de fibroblastos primarios aislados de músculos esqueléticos de ratones adultos, seguido de la purificación y caracterización de exosomas de los medios de cultivo de estas células. El método se basa en el uso de pasos secuenciales de centrifugación seguidos de gradientes de densidad de sacarosa. A continuación, se valida la pureza de las preparaciones exosomales mediante análisis de Western blot utilizando una batería de marcadores canónicos (es decir, Alix, CD9 y CD81). El protocolo describe cómo aislar y concentrar exosomas bioactivos para microscopía electrónica, espectrometría de masas y experimentos de captación para estudios funcionales. Puede ampliarse o reducirse fácilmente y adaptarse para el aislamiento de exosomas de diferentes tipos de células, tejidos y fluidos biológicos.
Introduction
Los exosomas son vesículas extracelulares heterogéneas que varían en tamaño de 30 a 150 nm. Se han establecido actores clave en los procesos fisiológicos y patológicos, dada su distribución ubicua en tejidos y órganos 1,2. Los exosomas transportan una carga compleja de proteínas, lípidos, tipos de ADN y tipos de ARN, que varían según el tipo de células de las que se derivan 1,2,3. Los exosomas están enriquecidos en proteínas que tienen diferentes funciones (es decir, las tetraspaninas, incluidas CD9 y CD63) son responsables de los eventos de fusión. Por ejemplo, las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90 están involucradas en la unión y presentación de antígenos. Además, Alix, Tsg101 y flotillina participan en la biogénesis y liberación de exosomas y son ampliamente utilizados como marcadores de estas nanovesículas 2,3,4.
Los exosomas también contienen una variedad de ARN (es decir, microARN, ARN largos no codificantes, ARN ribosómicos) que pueden transferirse a las células receptoras, donde influyenen la señalización posterior. Al estar encerrada por una sola unidad de membrana, la bioactividad de los exosomas depende no solo de la carga de proteínas y ácidos nucleicos, sino también de los componentes lipídicos de la membrana limitante. Las membranas exosómicas están enriquecidas en fosfatidilserina, ácido fosfatídico, colesterol, esfingomielina, ácido araquidónico y otros ácidos grasos, todos los cuales pueden influir en la estabilidad de los exosomas y la topología de la membrana 2,3. Como resultado de la disposición de la carga y los lípidos, los exosomas inician vías de señalización en las células receptoras y participan en el mantenimiento de la fisiología tisular normal 1,2,4,5. Bajo ciertas condiciones patológicas (es decir, neurodegeneración, fibrosis y cáncer), se ha demostrado que desencadenan y propagan estímulos patológicos 4,6,7,8,9,10,11.
Debido a su capacidad para propagar señales a sitios vecinos o distantes, los exosomas se han convertido en biomarcadores valiosos para el diagnóstico o pronóstico de enfermedades. Además, los exosomas se han utilizado experimentalmente como vehículos de compuestos terapéuticos 2,12. La posible aplicación de estas nanovesículas en la clínica hace que el método de aislamiento sea cada vez más importante para lograr el máximo rendimiento, pureza y reproducibilidad. Se han desarrollado e implementado diferentes técnicas para el aislamiento de exosomas. En general, los exosomas se pueden aislar de medios de cultivo celular acondicionados o fluidos corporales mediante centrifugación diferencial, cromatografía de exclusión por tamaño y captura inmunitaria (utilizando kits disponibles comercialmente). Cada enfoque tiene ventajas y desventajas únicas que se han discutido anteriormente 1,2,13,14.
El protocolo descrito se centra en 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto y 2) la purificación y caracterización de los exosomas liberados en el medio de cultivo por estas células. Actualmente se carece de un protocolo bien establecido para el aislamiento de exosomas de fibroblastos primarios para estudios funcionales. Los fibroblastos primarios no secretan grandes cantidades de exosomas, lo que dificulta el proceso de aislamiento y purificación. Este protocolo describe la purificación de grandes cantidades de exosomas puros a partir de grandes volúmenes de cultivo, manteniendo su integridad morfológica y actividad funcional. Los exosomas purificados obtenidos a partir de medio acondicionado se han utilizado con éxito en experimentos de captación in vitro para inducir vías de señalización específicas en las células receptoras. También se han utilizado para análisis proteómicos comparativos de cargas exosomales de múltiples muestras biológicas4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un paso crítico para el aislamiento exitoso de los exosomas de los medios de cultivo, como se describe en este protocolo, es el establecimiento y mantenimiento adecuados de cultivos primarios de fibroblastos de ratón a partir de músculo esquelético adulto. Estos cultivos deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar condiciones similares a las fisiológicas (el nivel de O2 en el músculo esquelético es de ~2,5%)15. Los fibroblastos primarios cambiarán de caracterís…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alessandra d’Azzo es titular de la Cátedra de Genética y Terapia Génica de Jewelers for Children (JFC). Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los NIH R01GM104981, RO1DK095169 y CA021764, la Fundación Asís de Memphis y las Caridades Asociadas Sirio-Libanesas Estadounidenses.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Riferimenti
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