Preparação de Eletrodos de Estimulação Nervosa Periférica para Implantação Crônica em Ratos
Summary
Abordagens existentes para a construção de eletrodos de manguito nervoso periférico cronicamente implantáveis para uso em pequenos roedores muitas vezes requerem equipamentos especializados e/ou pessoal altamente treinado. Neste protocolo, demonstramos uma abordagem simples e de baixo custo para a fabricação de eletrodos de manguitos cronicamente implantáveis, e demonstramos sua eficácia para a estimulação do nervo vago (VNS) em ratos.
Abstract
Eletrodos de manguito nervoso periférico têm sido usados há muito tempo nas neurociências e campos relacionados para estimulação de, por exemplo, vagus ou nervos ciáticos. Vários estudos recentes demonstraram a eficácia do VNS crônico no aumento da plasticidade do sistema nervoso central para melhorar a reabilitação motora, a aprendizagem da extinção e a discriminação sensorial. A construção de dispositivos cronicamente implantáveis para uso em tais estudos é desafiadora devido ao pequeno tamanho dos ratos, e protocolos típicos exigem treinamento extensivo de pessoal e métodos de microfabricação demorados. Alternativamente, eletrodos de punho implantáveis disponíveis comercialmente podem ser comprados a um custo significativamente maior. Neste protocolo, apresentamos um método simples e de baixo custo para a construção de eletrodos de punho nervoso periférico pequenos e cronicamente implantáveis para uso em ratos. Validamos a confiabilidade a curto e longo prazo de nossos eletrodos de punho, demonstrando que vns em ratos anestesizados cetamina/xilazina produz reduções na taxa de respiração consistente com a ativação do reflexo Hering-Breuer, tanto no momento da implantação quanto até 10 semanas após a implantação do dispositivo. Demonstramos ainda a adequação dos eletrodos de punho para uso em estudos de estimulação crônica, emparelhando VNS com desempenho de prensa de alavanca qualificada para induzir plasticidade do mapa cortical motor.
Introduction
Recentemente, cresceu a demanda por eletrodos de manguitos cronicamente implantáveis para estimulação de nervos periféricos, pois estudos demonstram cada vez mais a utilidade pré-clínica dessa técnica para o tratamento de inúmeras doenças inflamatórias1,,2,3 e distúrbios neurológicos4,,5,,6,,7,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15. O VNS crônico, por exemplo, tem se mostrado para melhorar a plasticidade neocortical em uma variedade de contextos de aprendizagem, melhorando a reabilitação motora4,5,,6,,7,8, aprendizagem de extinção10,,11,,12,,13,,14, e discriminação sensorial15. Eletrodos de manguito nervoso periférico comercialmente disponíveis são frequentemente associados a tempos prolongados para cumprimento do pedido e custos relativamente altos, o que pode limitar sua acessibilidade. Alternativamente, os protocolos para fabricação “interna” de eletrodos de manguitos cronicamente implantáveis permanecem limitados, e a anatomia dos roedores apresenta desafios particulares devido ao seu pequeno tamanho. Os protocolos atuais para a construção de eletrodos de punho para experimentos crônicos de roedores muitas vezes requerem o uso de equipamentos e técnicas complexas, bem como pessoal extensivamente treinado. Neste protocolo, demonstramos uma abordagem simplificada para a fabricação de eletrodos de manguito com base nos métodos publicados e amplamente utilizados16,17. Validamos a funcionalidade de nossos eletrodos cronicamente implantados em ratos, demonstrando que, no momento da implantação da braçadeira ao redor do nervo vago cervical esquerdo, a estimulação aplicada aos eletrodos do punho produziu com sucesso uma cessação da respiração e queda em SpO2. A estimulação de fibras vagal do receptor pulmonar aferentes é conhecida por engajar o reflexo hering-breuer, no qual a inibição de vários núcleos respiratórios no tronco cerebral resulta na inspiração de supressão18. Assim, a cessação da respiração consistente com o reflexo hering-breuer, e a queda resultante em SpO2, fornecem um teste simples para implantação adequada de eletrodos e função de manguito em ratos anestesiados. Para validar a funcionalidade de longo prazo dos eletrodos de manguitos cronicamente implantados, as respostas reflexas foram medidas no momento da implantação e comparadas às respostas obtidas nos mesmos animais seis semanas após a implantação. Um segundo grupo de ratos foi implantado com eletrodos de manguito VNS após treinamento comportamental em uma tarefa de prensagem de alavanca. Nestes ratos, o VNS emparelhado com o desempenho correto da tarefa produziu reorganização do mapa motor cortical, consistente com estudos publicados anteriormente19,,20,,21,22. No momento do mapeamento cortical motor sob anestesia, que ocorreu de 5 a 10 semanas após a implantação do dispositivo, validamos ainda mais a função de manguito em animais tratados com VNS, confirmando que o VNS induziu com sucesso uma cessação da respiração e uma queda superior a 5% no SpO2.
Os protocolos recém-publicados de Childs et al.17 e Rios et al.16 fornecem um ponto de partida bem validado para uma abordagem simplificada de fabricação de eletrodos de manguito, uma vez que este método popular tem sido utilizado por vários laboratórios que realizam estudos crônicos de VNS em roedores1,,2,3,,4,,5,6,,7,,8,,9,,10,,11. O método original envolve várias etapas de alta precisão para manipular os microfios finos, de modo que a fabricação de eletrodos de punho leva mais de uma hora para ser concluída, e treinamento extensivo para executar de forma confiável. A abordagem simplificada descrita aqui requer significativamente menos materiais e ferramentas e pode ser concluída em menos de uma hora por pessoal minimamente treinado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos uma abordagem simples e de baixo custo para a montagem de eletrodos de punho estimulantes cronicamente implantáveis para uso em roedores, facilitando investigações pré-clínicas desta terapia emergente. Este método simplificado não requer treinamento ou equipamento especializado, e utiliza um pequeno número de ferramentas e suprimentos que são facilmente acessíveis à maioria dos laboratórios de pesquisa, reduzindo tanto os custos monetários quanto trabalhistas da fabricação de dispositivos …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Universidade do Texas em Dallas e pelo Conselho de Regentes da UT. Agradecemos a Solomon Golding, Bilaal Hassan, Marghi Jani e Ching-Tzu Tseng por assistência técnica.
Materials
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
Riferimenti
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson’s disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F. Inflation reflex in the rat. Physiologia Bohemoslov. , (1975).
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
