Qui è riportato un protocollo per la quantificazione di particelle virali infettive utilizzando il monitoraggio in tempo reale dell'impedenza elettrica delle cellule infette. Un'applicazione pratica di questo metodo è presentata quantificando il decadimento del virus dell'influenza A in diversi parametri fisico-chimici che imitano le condizioni ambientali.
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Articolo metodologico
Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metodi per la quantificazione delle particelle virali rappresentano un aspetto critico di molti studi di virologia. Sebbene esistano diverse tecniche affidabili, richiedono molto tempo o non sono in grado di rilevare piccole variazioni. Qui viene presentato un protocollo per la quantificazione precisa del titolo virale analizzando le variazioni di impedenza elettrica delle cellule infette in tempo reale. L'impedenza cellulare viene misurata attraverso biosensori a microelettrodi d'oro situati sotto le cellule in micropiastre, in cui la grandezza dipende dal numero di cellule, nonché dalle loro dimensioni e forma. Questo protocollo consente l'analisi in tempo reale della proliferazione cellulare, della vitalità, della morfologia e della migrazione con maggiore sensibilità. Viene inoltre fornito un esempio di applicazione pratica quantificando il decadimento del virus dell'influenza A (IAV) sottoposto a vari parametri fisico-chimici che influenzano l'infettività virale nel tempo (cioè temperatura, salinità e pH). Per tali applicazioni, il protocollo riduce il carico di lavoro necessario, generando al contempo dati di quantificazione precisi delle particelle virali infettive. Permette il confronto delle pendenze di inattivazione tra diversi IAV, che riflette la loro capacità di persistere in un determinato ambiente. Questo protocollo è facile da eseguire, è altamente riproducibile e può essere applicato a qualsiasi virus che produce effetti citopatici in coltura cellulare.
Introduzione
La trasmissione di un virus si basa sulla combinazione di diversi fattori. Per un virus secreto nell'ambiente, la sua trasmissione dipende anche dalla capacità di persistere in condizioni al di fuori dell'ospite. Studiare l'inattivazione virale in generale è, quindi, un passo cruciale per aiutare le autorità sanitarie nazionali e i responsabili politici ad attuare misure di controllo e biosicurezza.
La conoscenza della persistenza del virus in ambienti naturali e di laboratorio è aumentata considerevolmente nell'ultimo decennio. Nel caso dei virus dell'influenza A (IAV), le loro vie di trasmissione sottopongono le particelle virali a una va....
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Protocollo
Gestire tutti i virus influenzali in base ai requisiti appropriati del livello di biosicurezza (BSL-2 o superiore a seconda del sottotipo). Utilizzare ceppi IAV con una storia di passaggio basso (meno di 5 volte sulle cellule MDCK) per assicurare una bassa variazione tra gli esperimenti.
1. Preparazione dei reagenti e delle materie prime
- Preparazione di cellule MDCK e terreno di coltura cellulare sterile
- Coltivare cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK) in mezzo di Eagle modificato (MEM) integrato con siero fetale inattivato al 10% di calore (FCS) e antibiotici (100 unità / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicin....
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Risultati
I dati grezzi ottenuti dopo 120 ore con diverse concentrazioni di cellule MDCK, da 15.000 a 120.000 cellule per pozzetto, sono mostrati nella Figura 1. Dopo 24 ore, le misure di IC mostrano che le cellule nei pozzi seminati con 30.000 cellule erano ancora nella fase esponenziale di crescita, e questa concentrazione cellulare è stata utilizzata per ulteriori esperimenti. La Figura 2 illustra la correlazione lineare tra i valori cit50 e la molteplicità .......
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Discussione
RTCA è una tecnologia basata sull'impedenza che viene sempre più utilizzata per il monitoraggio in tempo reale delle proprietà cellulari, come l'aderenza cellulare, la proliferazione, la migrazione e la citotossicità. In questo studio, la capacità di questa tecnologia di valutare la sopravvivenza IAV al di fuori dell'ospite è dimostrata misurando la pendenza dell'inattivazione del virus. Tecniche meticolose come TCID50 e saggi di placca sono sostituite da una valutazione obiettiva in tempo reale della vitalità.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25%Tripsina | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 pallone per coltura tissutale | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 piastre) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | Le E-plates sono disponibili in diverse confezioni |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillina-Streptomicina | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | Gli strumenti xCELLigence RTCA S16 sono disponibili in diversi formati (16 pozzetti, 96 pozzetti, piastra singola o multipla) |
Riferimenti
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (....
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Ristampe e permessi
