कृमि-संरेखित/Worm_CP एक सरल फिजी/सेलप्रोफिलर वर्कफ्लो है जिसका उपयोग कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस नमूनों को सीधा और संरेखित करने और पूर्व प्रशिक्षण चरणों की आवश्यकता के बिना पूरे कृमि छवि-आधारित परख को स्कोर करने के लिए किया जा सकता है। हमने जीवित जानवरों या लिपिड बूंदों में गर्म-सदमे प्रेरित अभिव्यक्ति के मात्राकरण के लिए कृमि-संरेखित/Worm_CP को निर्धारित नमूनों में लागू किया है ।
फिक्स्ड या एनेस्थेटाइज्ड सी एलिगेंस से इमेज डेटा प्राप्त करते समय अक्सर एक मुद्दा सामना करना पड़ता है कि कीड़े अपने पड़ोसियों के साथ क्रॉस और क्लस्टर करते हैं। यह समस्या कीड़े के बढ़ते घनत्व के साथ बढ़ जाती है और इमेजिंग और मात्राकरण के लिए चुनौतियां पैदा करती है। हमने एक फिजी-आधारित कार्यप्रवाह, वर्म-रिलाइन विकसित किया है, जिसका उपयोग सी एलिगेंस के कच्चे छवि डेटा से उपयोगकर्ता-चयनित, सीधे और गठबंधन कीड़े के एकल या बहु-चैनल असेंबल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। वर्म-एलाइन एक सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल कार्यप्रवाह है जिसे उपयोगकर्ता या विश्लेषण एल्गोरिदम के पूर्व प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है। कीड़े-संरेखित के साथ उत्पन्न असेंबल कीड़े के दृश्य निरीक्षण, उनके वर्गीकरण और प्रतिनिधित्व में सहायता कर सकते हैं। इसके अलावा, कृमि-संरेखित के उत्पादन का उपयोग सीधे फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद की मात्रा के लिए किया जा सकता है। हम Worm_CP में कीड़ा-संरेखित उत्पादन का आयात करके इसे प्रदर्शित करते हैं, एक पाइपलाइन जो ओपन-सोर्स सेलप्रोफिलर सॉफ्टवेयर का उपयोग करती है। सेलप्रोफिलर का लचीलापन उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अतिरिक्त मॉड्यूल के समावेश को सक्षम बनाता है। एक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, हमने दो डेटासेट पर पाइपलाइन का उपयोग किया है: पहला डेटासेट हीट शॉक रिपोर्टर कीड़े की छवियां हैं जो हीट शॉक अकक्षीय जीन एचएसपी-70के प्रमोटर के नियंत्रण में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हैं, और दूसरा डेटासेट निश्चित कीड़े से प्राप्त छवियां हैं, जो फ्लोरोसेंट डाई के साथ वसा-भंडारों के लिए सना हुआ है।
एक अपेक्षाकृत सरल जीव, सूत्रकृमि सी एलिगेंस,मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल प्रणाली है। सी एलिगेंस जीनोम में लगभग 38% जीन मनुष्यों में कार्यात्मक समकक्ष हैं1,2. सी एलिगेंस की अनूठी विशेषताओं में से एक यह है कि यह ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है, जो ऊतकों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की (उप) सेलुलर अभिव्यक्ति के बारे में वीवो जानकारी में आसान पहुंच को सक्षम करता है। यह सी एलिगेंस को इमेज-आधारित प्लेटफॉर्म3का उपयोग करके उच्च सामग्री वाली स्क्रीन के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव बनाता है। हालांकि, एक मुद्दा जो अक्सर इन अध्ययनों को जटिल बनाता है, वह यह है कि जब कीड़े की घनी आबादी इमेजिंग करते हैं, तो वे पार करते हैं और क्लस्टर करते हैं, व्यक्तिगत कीड़े में तुलना को चुनौती देते हैं, डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण और क्वांटिटेशन को धूमिल करते हैं।
इस मुद्दे को दूर करने वाले मौजूदा समाधान आमतौर पर संस्कृति और इमेजिंग प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर भरोसा करते हैं, जैसे माइक्रो-फ्लूइडिक्स सेटअप4के उपयोग के माध्यम से, एकल कीड़े को अलग-अलग छवियों में कैप्चर करने की अनुमति देता है5,6। दूसरों ने मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम लागू किया है जो एकल कीड़े की मान्यता के लिए अनुमति देता है, यहां तक कि एक झुरमुट आबादी में भी। उत्तरार्द्ध का एक उत्कृष्ट उदाहरण वर्मटूलबॉक्स है, जो ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस प्लेटफॉर्म, सेलप्रोफिलर7का मॉड्यूलर विस्तार है। वर्मटूलबॉक्स सी एलिगेंसके विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट और उच्च सामग्री समाधान प्रदान करता है, और सेलप्रोफिलर में इसके शामिल होने से स्पष्ट रूप से लाभ उठाता है, क्योंकि अतिरिक्त विश्लेषण मॉड्यूल आसानी से शामिल किए जा सकते हैं। हालांकि वर्मटूलबॉक्स एक पूर्व प्रशिक्षित मॉडल (डिफ़ॉल्ट वर्मवर्ममॉडल.xml) के साथ आपूर्ति की जाती है, मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम का पुनर्प्रशिक्षण आमतौर पर प्रत्येक नए आवेदन के लिए आवश्यक होता है। यह कैसे करना है पर ऑनलाइन ट्यूटोरियल गिथब (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) पर उपलब्ध हैं। इसके बावजूद, वर्मटूलबॉक्स को स्थापित करने और उपयोग करने के लिए नौसिखिए उपयोगकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण समय-निवेश की आवश्यकता होती है।
यहां, हम संस्कृति के लिए एक सरल और लागत और समय प्रभावी प्रोटोकॉल, और सी एलिगेंस की छवि आबादी का वर्णन करते हैं। अधिग्रहीत छवियों में व्यक्तिगत कीड़े के आकलन की अनुमति देने के लिए हमने एक साधारण ओपन-सोर्स फिजी-आधारित कार्यप्रवाह विकसित किया है, जिसका नाम वर्म-एलाइन है। कृमि-संरेखण का उपयोग सीधे और गठबंधन कीड़े के एकल या बहु-चैनल असेंबल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। सबसे पहले, उपयोगकर्ता को मैन्युअल रूप से सिर से पूंछ तक एक लाइन खींचकर विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कीड़े का चयन करना होगा। कृमि-संरेखण अवलोकन छवि से चयनित कीड़े को फसल करने के लिए इस चयन का उपयोग करेगा, और एक असेंबल उत्पन्न करेगा जिसमें चयनित कीड़े को सीधा किया जाता है और दृश्य तुलना और प्रस्तुति की सुविधा के लिए गठबंधन किया जाता है।
इसके अलावा, कृमि-संरेखित के उत्पादन का उपयोग सीधे फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद की मात्रा के लिए किया जा सकता है। हम Worm_CP में कीड़ा-संरेखित उत्पादन का आयात करके इसे प्रदर्शित करते हैं, एक पाइपलाइन जो ओपन-सोर्स सेलप्रोफिलर सॉफ्टवेयर का उपयोग करती है। सेलप्रोफिलर का लचीलापन उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अतिरिक्त मॉड्यूल के समावेश को सक्षम बनाता है। हमने हीट शॉक रिस्पांस को निर्धारित करने के लिए Worm_CP पाइपलाइन का उपयोग किया है, एक अच्छी तरह से संरक्षित सुरक्षात्मक तंत्र जो प्रोटीन को फिर से गुना करता है जो उच्च तापमान 8 जैसे तनावों के कारण गलतहोताहै। विशेष रूप से, हमने एक एकीकृत मल्टी-कॉपी ट्रांसजीन ले जाने वाले कीड़े के लिए पाइपलाइन लागू की, जहां गर्मी के झटके में जीन, एचएसपी-70 (C12C8.1) के प्रमोटर, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)9चलाता है। हमने निश्चित जानवरों पर Worm_CP पाइपलाइन का भी उपयोग किया है जिसे फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया है जो लिपिड बूंदों (एलडी) की कल्पना करता है, सी एलिगेंस10में मुख्य वसा भंडारण ऑर्गेनेल। हालांकि इस वर्कफ्लो में वर्मटूलबॉक्स द्वारा पेश किया गया थ्रूपुट नहीं है, लेकिन यह दृश्य प्रस्तुति और छवि-आधारित सी एलिगेंस प्रयोगों के विश्लेषण के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और सरल विकल्प है।
वर्म-रिलॉर्ड एक फिजी-आधारित छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन है जो उपयोगकर्ता-चयनित कीड़े के असेंबल को आसानी से उत्पन्न करती है, जिसमें कीड़े को सीधा किया जाता है और दृश्य तुलना, वर्गीकरण और प्रतिनिधित्व की सहायता के लिए गठबंधन किया जाता है। यद्यपि यह सुविधा कुछ मौजूदा उपकरणों द्वारा भी पेश की जाती है, विशेष रूप से सेलप्रोफिलर7में वर्मटूलबॉक्स मॉड्यूल, वर्म-रिलॉर्ड को तुलनात्मक रूप से कम पूर्व छवि विश्लेषण अनुभव की आवश्यकता होती है: उपयोगकर्ताओं को केवल उन कीड़े का पता लगाने की आवश्यकता होती है जिन्हें वे असेंबल (और विश्लेषण) के लिए चुनना चाहते हैं। हालांकि कच्चे छवि डेटा पर कीड़े का पता लगाना एक आसान प्रक्रिया है-विशेष रूप से जब एक टच स्क्रीन कंप्यूटर या टैबलेट उपलब्ध है-, यह सर्वोपरि है, कि लाइनों को सही ढंग से कीड़े की देशांतर धुरी के साथ तैयार कर रहे हैं । अधूरी रेखाएं, जो कीड़े के केवल हिस्से का पालन करती हैं, असेंबल (यानी, पूंछ के सिर गायब कीड़े) और सेलप्रोफिलर विश्लेषण के दौरान आंशिक विभाजन मास्क में आंशिक कीड़े का परिणाम होगा। इसके अलावा, यदि दो व्यक्तिगत कीड़े से लाइनें पार करती हैं, तो कीड़े संरेखण असेंबल के साथ-साथ फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन के लिए सही ढंग से संसाधित नहीं किए जाएंगे। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मूल छवि पर लाइन चयन की एक ओवरले छवि डेटा फ़ोल्डर में सहेजी जाती है, साथ ही क्यूसी टेबल के साथ। इन से, समस्याग्रस्त लाइनों है कि गलत तरीके से खंडित कीड़े के लिए नेतृत्व करेंगे आसानी से पहचान की और असेंबल और/या बाद के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है ।
यद्यपि कीड़े के चयन में प्रयोगकर्ता से प्रत्यक्ष इनपुट शायद थोड़ा समय लेने वाला लगता है, यह प्रयोगों में दूसरों पर कार्यप्रवाह का स्पष्ट लाभ प्रस्तुत करता है जहां विभिन्न विकासात्मक चरणों से कीड़े एक ही छवि में मौजूद होते हैं: कीड़े को “ट्रेसिंग चरण” के दौरान चुना जा सकता है, केवल उन कीड़े को रेखांकित करके जो सही विकासात्मक चरण में हैं। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को ट्रेसिंग लाइन की लंबाई, या विभाजन मुखौटा के क्षेत्र, कीड़े की लंबाई/आकार के दोनों विश्वसनीय संकेतकों के आधार पर Worm_CP से आउटपुट का उपयोग करके फ़िल्टर किया जा सकता है। यकीनन, मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम विभिन्न विकासात्मक चरणों से कीड़े को पहचानने के लिए संघर्ष कर सकते हैं, क्योंकि डीआईसी छवियों में उनका आकार और उपस्थिति बहुत अलग है।
कृमि-संरेखित के उत्पादन का उपयोग सीधे फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद की मात्रा के लिए किया जा सकता है। हमने वर्म-रिलाइन आउटपुट को एक साधारण सेलप्रोफिलर पाइपलाइन (Worm_CP) में आयात करके इसका प्रदर्शन किया, जो उन व्यक्तिगत कीड़े में बहु-चैनल फ्लोरेसेंस तीव्रता के मात्राकरण की अनुमति देता है जिन्हें कृमि-संरेखित पाइपलाइन चलाते समय चुना गया था। हमने सेलप्रोफिलर सॉफ़्टवेयर के लचीलेपन के कारण इस दृष्टिकोण को चुना: व्यक्तिगत कीड़े में अतिरिक्त सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए पाइपलाइन में अतिरिक्त मॉड्यूल को शामिल करना सीधा है (उदाहरण के लिए लिपिड बूंदों के आकार को मापना, या तनाव कणिकाओं, नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया)। इसके अलावा, एक कृमि मास्क संभवतः WormToolbox7के लिए एक नया मॉडल प्रशिक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस विधि के मुख्य फायदे यह हैं कि यह तेज है और इसके लिए एक साधारण कीड़ा बढ़ते सेट-अप की आवश्यकता होती है। यह विधि तेज है क्योंकि इसके लिए सॉफ्टवेयर ऑपरेशन सीखने में समय बिताने की आवश्यकता नहीं होती है और न ही मशीन एल्गोरिदम7के माध्यम से प्रशिक्षण सेट चलाने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह विधि या तो लाइव या निश्चित कीड़े के साथ काम करती है जो नियमित रूप से एगरेग्मेंट पैड पर घुड़सवार होती है। जटिल माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करने की कोई आवश्यकता नहीं है, जैसा कि अन्य तरीकों में विकसित किया गया है5,6।
The authors have nothing to disclose.
हम बायोसीईवी (प्राग, चेक गणराज्य) में डॉ क्रिश्चियन लैंक्टोट को धन्यवाद देना चाहते हैं ताकि हमें माउथ माइक्रोपिपेट पर सुरक्षा सेटअप साझा करने के लिए फिक्स्ड कीड़े और डॉ फातिमा सैंटोस और डॉ डेबी ड्रेज को माउंट करने के लिए माउथ माइक्रोपिपेट तकनीक सिखाई जा सके । हम पांडुलिपि, शर्लीन मर्डोक और बाबरहाम संस्थान सुविधाओं को उनके समर्थन के लिए संपादित करने के लिए फ्रांसिस्का हॉज को भी धन्यवाद देते हैं । ओसी ईआरसी 638426 और BBSRC [BBS/E/B000C0426] द्वारा समर्थित है।
Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Beaker | |||
BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
Conical flask | |||
Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Isopropanol | |||
Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microwave Oven | Delongi | ||
M9 | prepared in the lab according to15 | ||
9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
PBS | prepared in the lab | ||
Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Rotator | Stuart Scientific | ||
Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |