Worm-align/Worm_CP är ett enkelt FIJI/CellProfiler-arbetsflöde som kan användas för att räta ut och rikta In Caenorhabditis elegans-prover och för att göra poäng med bildbaserade analyser med hela mask utan behov av föregående utbildningssteg. Vi har tillämpat Worm-align/Worm_CP till kvantifieringen av värme-chock inducerad uttryck i levande djur eller lipiddroppar i fasta prover.
Ett problem som ofta påträffas när man skaffar bilddata från fast eller sövd C. elegans är att maskar korsar och kluster med sina grannar. Detta problem förvärras med ökande täthet av maskar och skapar utmaningar för bildbehandling och kvantifiering. Vi utvecklade ett FIJI-baserat arbetsflöde, Worm-align, som kan användas för att generera enkel- eller flerkanalsmontage av användarvalda, rätade och anpassade maskar från råa bilddata av C. elegans. Worm-align är ett enkelt och användarvänligt arbetsflöde som inte kräver föregående utbildning av vare sig användaren eller analysalgoritmen. Montage som genereras med Worm-align kan hjälpa den visuella inspektionen av maskar, deras klassificering och representation. Dessutom kan produktionen av Worm-align användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata Worm_CP, en pipeline som använder programvaran CellProfiler med öppen källkod. CellProfilers flexibilitet möjliggör införlivandet av ytterligare moduler för screening med hög innehåll. Som ett praktiskt exempel har vi använt rörledningen på två datamängder: den första datauppsättningen är bilder av värmechock reporter maskar som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av promotorn för en värmechock inducible gen hsp-70, och den andra datauppsättningen är bilder som erhållits från fasta maskar, färgas för fett-butiker med en fluorescerande färgämne.
En relativt enkel organism, nematoden C. elegans, är ett extremt användbart modellsystem för att studera mänskliga sjukdomar. Omkring 38% av generna i C. elegans genomet har funktionella motsvarigheter hos människor1,2. En av de unika egenskaperna hos C. elegans är att det är optiskt transparent, vilket möjliggör enkel tillgång till in vivo information om (sub) cellulära uttryck av fluorescerande reportrar över vävnader. Detta gör C. elegans till en utmärkt modellorganism för skärmar med hög innehållshalt med hjälp av bildbaserade plattformar3. Men en fråga som ofta komplicerar dessa studier är att när imaging täta populationer av maskar, de tenderar att korsa och kluster, vilket gör jämförelser mellan enskilda maskar utmanande, grumlar nedströms bildanalys och kvantifiering.
Befintliga lösningar som övervinner denna fråga förlitar sig vanligtvis på optimering av protokollet för odling och bildframställning, till exempel genom användning av mikro-fluidikuppställningar4, vilket gör att enstaka maskar kan fångas iseparata bilder 5,6. Andra har tillämpat maskininlärningsalgoritmer som möjliggör erkännande av enstaka maskar, även i en klumpig population. Ett utmärkt exempel på det senare är WormToolbox, som är en modulär förlängning av den öppna källkoden bild analysplattform, CellProfiler7. WormToolbox erbjuder en lösning med hög genomströmning och hög innehållslig lösning för analys av C. elegans, och drar klart nytta av att den ingår i CellProfiler, eftersom ytterligare analysmoduler enkelt kan inkluderas. Även om WormToolbox levereras med en förtränad modell (DefaultWormModel.xml), krävs omskolning av maskininlärningsalgoritmen vanligtvis för varje nytt program. Online tutorials om hur man gör detta finns på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Trots detta, installera och använda WormToolbox kräver en betydande tid-investering för nybörjare användare.
Här beskriver vi ett enkelt och kostnads- och tids-effektivt protokoll till kultur, och bildpopulationer av C. elegans. För att möjliggöra bedömning av enskilda maskar i de förvärvade bilderna har vi utvecklat en enkel öppen källkod FIJI-baserade arbetsflöde, med namnet Worm-align. Worm-align kan användas för att generera en- eller flerkanalsmontage av uträtade och anpassade maskar. För det första måste användaren manuellt välja enskilda maskar för analys genom att dra en linje från huvudet till svansen. Worm-align kommer att använda detta urval för att beskära valda maskar från översiktsbilden, och generera ett montage där valda maskar rätas och justeras för att underlätta visuell jämförelse och presentation.
Dessutom kan produktionen av Worm-align användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata Worm_CP, en pipeline som använder programvaran CellProfiler med öppen källkod. CellProfilers flexibilitet möjliggör införlivandet av ytterligare moduler för screening med hög innehåll. Vi har använt Worm_CP pipeline för att kvantifiera värmechock svar, en väl bevarad skyddsmekanism som återfölrar proteiner som är felvikt på grund av stressfaktorer såsom hög temperatur8. Specifikt tillämpade vi rörledningen på maskar som bär en integrerad multi-kopia transgen, där främjare av en värmechock inducerbar gen, hsp-70(C12C8.1), driver grön fluorescerande protein (GFP)9. Vi har också använt Worm_CP-ledningen på fasta djur som har märkts med ett fluorescerande färgämne som visualiserar lipiddroppar (LDs), den viktigaste fettlagringsorganellen i C. elegans10. Även om detta arbetsflöde inte har det dataflöde som erbjuds av WormToolBox, är det ett användarvänligt och enkelt alternativ för visuell presentation och analys av bildbaserade C. elegans-experiment.
Worm-align är en FIJI-baserad bildbehandling pipeline som lätt genererar montage av användarvalda maskar, där maskar rätas och anpassas för att underlätta visuell jämförelse, klassificering och representation. Även om denna funktion erbjuds också av vissa befintliga verktyg, särskilt WormToolbox-modulen i CellProfiler7, kräver Worm-align jämförelsevis lite tidigare bildanalysupplevelse: Användare behöver bara spåra de maskar som de skulle vilja välja för montaget (och analysen). Även spåra maskar på rå bilddata är en enkel process-särskilt när en pekskärm dator eller surfplatta är tillgänglig-, är det av största vikt, att linjerna är korrekt dras längs den längsgående axeln av maskarna. Ofullständiga linjer, som följer endast en del av masken, kommer att resultera i partiella maskar i montaget (dvs, maskar saknas huvuden av svansändar) och partiell segmentering masker under CellProfiler analys. Dessutom, om linjer från två enskilda maskar kors, maskarna kommer inte att korrekt bearbetas i masken anpassning montage samt för fluorescens kvantifiering. För kvalitetskontroll en överlagringsbild av linjevalen på den ursprungliga bilden sparas i mappen data, tillsammans med en QC-tabell. Från dessa kan problematiska linjer som kommer att leda till felaktigt segmenterade maskar lätt identifieras och uteslutas från montage och /eller efterföljande analys.
Även om den direkta inmatningen från experimentören i valet av maskar kanske verkar lite tidskrävande, presenterar den en klar fördel av arbetsflödet framför andra i experiment där maskar från olika utvecklingsstadier finns i samma bild: Maskar kan väljas under “spårande steg”, genom att endast skissera de maskar som är i rätt utvecklingsstadium. Alternativt kan maskar filtreras med hjälp av utdata från Worm_CP baserat på antingen längden på spårningslinjen, eller området för segmenteringsmasken, båda tillförlitliga indikatorer på maskarnas längd/storlek. Förmodligen kan maskininlärningsalgoritmer kämpa för att känna igen maskar från olika utvecklingsstadier, eftersom deras storlek och utseende i DIC-bilderna är så olika.
Utdata från Worm-align kan användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visade detta genom att importera Worm-align-utdata till en enkel CellProfiler-pipeline (Worm_CP), som gör det möjligt att kvantifiering av flera kanaler fluorescens intensitet i de enskilda maskar som valdes medan du kör Worm-align pipeline. Vi valde detta tillvägagångssätt på grund av flexibiliteten i CellProfiler-programvaran: Det är enkelt att införliva ytterligare moduler i rörledningen för att analysera ytterligare funktioner i enskilda maskar (t.ex. mäta storleken på lipiddroppar, eller stressgranulat, kärnor, mitokondrier). Dessutom kan den enda mask masker potentiellt användas för att träna en ny modell för WormToolbox7.
De viktigaste fördelarna med denna metod är att det är snabbt och kräver en enkel mask montering set-up. Denna metod är snabbare eftersom det inte kräver att spendera tid lärande programvara drift och inte köra träningsuppsättningar genom en maskin algoritm7. Vidare, denna metod fungerar med antingen levande eller fasta maskar helt enkelt monterad på vanliga agaros kuddar. Det finns ingen anledning att använda komplexa mikrofluidiska kammare, som utvecklats i andra metoder5,6.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Christian Lanctôt vid BIOCEV (Prag, Tjeckien) för att lära oss munnen micropipette teknik för att montera fasta maskar och Dr Fatima Santos och Dr Debbie Drage för att dela säkerhet setup på munnen micropipette. Vi tackar också Francesca Hodge för redigering av manuskriptet, Sharlene Murdoch och Babraham Institute Facilities för deras stöd. OC stöds av ERC 638426 och BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Beaker | |||
BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
Conical flask | |||
Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Isopropanol | |||
Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microwave Oven | Delongi | ||
M9 | prepared in the lab according to15 | ||
9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
PBS | prepared in the lab | ||
Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Rotator | Stuart Scientific | ||
Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |