Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

Teresa  P. Silva; Tiago G. Fernandes; Diogo  E. S. Nogueira; Carlos  A. V. Rodrigues; Evguenia  P. Bekman; Yas Hashimura; Sunghoon Jung; Brian Lee; Maria Carmo-Fonseca; Joaquim  M. S. Cabral

doi:10.3791/61143

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Articolo metodologico

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

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DOI:

10.3791/61143

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13 giugno 2020

Teresa P. Silva¹^,² , Tiago G. Fernandes¹ , Diogo E. S. Nogueira¹ , Carlos A. V. Rodrigues¹ , Evguenia P. Bekman¹^,²^,³ , Yas Hashimura⁴ , Sunghoon Jung⁴ , Brian Lee⁴ , Maria Carmo-Fonseca² , Joaquim M. S. Cabral¹

¹iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, ²Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, ³The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, ⁴PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.

Abstract

Il cervelletto svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio e della coordinazione motoria, e un difetto funzionale in diversi neuroni cerebellari può innescare disfunzione cerebellare. La maggior parte delle conoscenze attuali sui fenotipi neuronali correlati alla malattia si basa sui tessuti post-mortem, il che rende difficile la comprensione della progressione e dello sviluppo della malattia. I modelli animali e le linee cellulari immortalate sono stati utilizzati anche come modelli per i disturbi neurodegenerativi. Tuttavia, non ricapitolano completamente la malattia umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) hanno un grande potenziale per la modellazione della malattia e forniscono una fonte preziosa per gli approcci rigenerativi. Negli ultimi anni, la generazione di organoidi cerebrali da iPSC derivati dal paziente ha migliorato le prospettive per la modellazione delle malattie neurodegenerative. Tuttavia, mancano protocolli che producono un gran numero di organoidi e un'elevata resa di neuroni maturi nei sistemi di coltura 3D. Il protocollo presentato è un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile di organoidi umani derivati da iPSC in condizioni chimicamente definite utilizzando bioreattori mono uso scalabili, in cui gli organoidi acquisiscono l'identità cerebellare. Gli organoidi generati sono caratterizzati dall'espressione di marcatori specifici sia a livello di mRNA che di proteine. L'analisi di specifici gruppi di proteine consente di rilevare diverse popolazioni di cellule cerebellari, la cui localizzazione è importante per la valutazione della struttura organoide. La criosezione organoide e l'ulteriore immunosostenimento delle fette organoidi vengono utilizzate per valutare la presenza di specifiche popolazioni di cellule cerebellari e della loro organizzazione spaziale.

Introduzione

L'emergere di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) rappresenta un ottimo strumento per la medicina rigenerativa e la modellazione della malattia, perché queste cellule possono essere differenziate nella maggior parte delle linee cellulari del corpo^{umano 1}^,². Dalla loro scoperta, la differenziazione PSC utilizzando approcci diversi è stata segnalata per modellare diverse malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi³^,⁴^,⁵^,⁶.

Recentemente, ci sono state ....