Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием
Summary
Этот протокол описывает динамическую культурную систему для производства контролируемых агрегатов размеров человеческих плюрипотентных стволовых клеток и дальнейшего стимулирования дифференциации мозжечковых органоидов в условиях, свободных от химических и фидерных, с использованием одноразового биореактора.
Abstract
Мозжечок играет важную роль в поддержании баланса и двигательной координации, а функциональный дефект в различных мозжечковых нейронах может вызвать мозжечковую дисфункцию. Большинство современных знаний о связанных с болезнями фенотипах нейронов основано на посмертных тканях, что затрудняет понимание прогрессирования и развития болезни. Модели животных и увековеченные клеточные линии также используются в качестве моделей для нейродегенеративных расстройств. Тем не менее, они не в полной мере повторить болезни человека. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) имеют большой потенциал для моделирования заболеваний и являются ценным источником регенеративных подходов. В последние годы генерация церебральных органоидов из iPSCs, полученных пациентом, улучшила перспективы моделирования нейродегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы, которые производят большое количество органоидов и высокий выход зрелых нейронов в системах 3D культуры отсутствуют. Представленный протокол представляет если представить новый подход к воспроизводимому и масштабируемому поколению органоидов, полученных человеком iPSC, в химически определенных условиях с использованием масштабируемых одноразових биореакторов, в которых органоиды приобретают мозжечковую идентичность. Генерируемые органоиды характеризуются экспрессией специфических маркеров как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Анализ конкретных групп белков позволяет выявлять различные популяции мозжечковых клеток, локализация которых важна для оценки органоидной структуры. Органоидная криозирование и дальнейшее иммуностеление органоидных ломтиков используются для оценки присутствия конкретных популяций мозжечковых клеток и их пространственной организации.
Introduction
Появление плюрипотентных стволовых клеток человека (PSCs) представляет собой отличный инструмент для регенеративной медицины и моделирования заболеваний, потому что эти клетки могут быть дифференцированы в большинстве клеточных линийчеловеческого тела 1,2. С момента своего открытия, PSC дифференциации с использованием различных подходов, как сообщается, модели различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных расстройств3,,4,,5,,6.
В последнее время появились сообщения о 3D-культурах, полученных из ПХК, напоминающих мозговые структуры человека; они называются органоидами мозга3,,7,,8. Поколение этих структур как из здоровых, так и для конкретных пациентов ПКС предоставляет ценную возможность для моделирования развития человека и расстройств нервного развития. Однако методы, используемые для создания этих хорошо организованных мозговых структур, трудно применить для их крупномасштабного производства. Для получения структур, которые достаточно велики, чтобы резюмировать морфогенез тканей без некроза внутри органоидов, протоколы полагаются на первоначальные нейронные обязательства в статических условиях, а затем инкапсуляции в гидрогелях и последующей культуры в динамическихсистемах 3. Однако такие подходы могут ограничить потенциальное масштабирование органоидного производства. Несмотря на то, что были предприняты усилия, чтобы направить дифференциацию PSC к определенным регионам центральной нервной системы, в том числе корковых, стриатальных, среднего мозга инейронов спинного мозга 9,10,11,12, генерация конкретных областей мозга в динамических условиях по-прежнему является проблемой. В частности, еще предстоит описать генерацию зрелых мозжечковых нейронов в 3D-структурах. Muguruma и др. впервые поколения культурных условий, которые recapitulate раннегомозжечка развития 13 и недавно сообщил протокол, который позволяет для человека эмбриональных стволовых клеток для создания поляризованной структуры напоминает первый триместр мозжечка7. Тем не менее, созревание мозжечковых нейронов в зарегистрированных исследованиях требует диссоциации органоидов, сортировки мозжечковых прародителей, и совместной культуры с клетками подачи всистеме культуры монослой 7,14,15,16. Таким образом, воспроизводимое поколение желаемых мозжечковых органоидов для моделирования заболеваний в определенных условиях по-прежнему является проблемой, связанной с культурой и изменчивостью источника подачи.
Этот протокол представляет оптимальные культурные условия для 3D-расширения и эффективной дифференциации человеческих ПКС на мозжечковые нейроны с использованием одноразовых вертикальных биореакторов колес (см. таблицу материалов для спецификаций), далее называемых биореакторами. Биореакторы оснащены большим вертикальным импеллером, который в сочетании с U-образным дном обеспечивает более однородное распределение снора внутри сосуда, позволяя нежному, равномерному смешиванию и подвеске частиц с уменьшенной скоростьювозбуждения 17. С помощью этой системы можно получить агрегаты клеток, контролируемые размером, что важно для более однородной и эффективной дифференциации. Кроме того, большее число органоидов, полученных из iPSC, может быть сгенерировано менее трудоемким образом.
Главной особенностью органоидов, которые являются 3D многоклеточные структуры обычно образуются из стволовых клеток, является самоорганизации различных типов клеток, которые образуют конкретные формы, как те, которыевидели в человеческих морфогенеза 18,19,20. Таким образом, органоидная морфология является важным критерием, который должен быть оценен в процессе дифференциации. Криозирование органоидов и дальнейшее иммуностентирование органоидных ломтиков с определенным набором антител позволяют пространственной визуализации молекулярных маркеров анализировать пролиферацию клеток, дифференциацию, идентичность популяции клеток и апоптоз. С помощью этого протокола, путем иммуностения органоидных cryosections, первоначальный эффективный нейронной приверженности наблюдается на7-й день дифференциации. Во время дифференциации наблюдается несколько популяций клеток с мозжечковой идентичностью. После 35 дней в этой динамической системе, мозжечковый нейроэпителий организуется вдоль апикобазальной оси, с апическим слоем размножающихся прародителей и базально расположенных постмитотических нейронов. Во время процесса созревания, с 35-90 дней дифференциации, различные типы мозжечковых нейронов можно увидеть, в том числе клетки Пуркинье (Calbindin+), гранулевые клетки (PAX6+/MAP2), Golgi клетки (Нейрогранин),однополярные клетки кисти (TBR2+), и глубокие мозжечковые ядра проекционныхнейронов(TBR1). Кроме того, незначительное количество клеточной смерти наблюдается в генерируемых мозжечковых органоидов после 90 дней в культуре.
В этой системе органоиды, полученные человеком iPSC, созревают в различные мозжечковые нейроны и выживают до 3 месяцев без необходимости диссоциации и кормушки кокультуры, обеспечивая источник мозжечковых нейронов человека для моделирования заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Потребность в больших количествах клеток, а также определенных культурных условиях для создания конкретных типов клеток для скрининга наркотиков и применения регенеративной медицины является движущей силой развития масштабируемых систем культуры. В последние годы несколько групп с…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Funda’o para a Ci’ncia e a Tecnologia (FCT), Португалия (UIDB/04565/2020 через Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Проект N. 007317, PD/BD/105773/2014 до T.P.S и PD/BD/128376/2017 до D.E.S.N.), проекты, совместно финансируемые FEDER (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa) PORTUGAL 2020) и FCT через грант PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 и CEREBEX Поколение мозжечковых органоидов для Ataxia Research грант LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Финансирование было также получено из Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 в соответствии с Грант-соглашением No 739572 -Центр регенеративной и точной медицины H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Biologia dello sviluppo. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Biologia dello sviluppo. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
