Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización
Summary
Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.
Abstract
El cerebelo desempeña un papel crítico en el mantenimiento del equilibrio y la coordinación motora, y un defecto funcional en diferentes neuronas cerebelosas puede desencadenar disfunción cerebelosa. La mayor parte del conocimiento actual sobre los fenotipos neuronales relacionados con la enfermedad se basa en los tejidos postmortem, lo que dificulta la comprensión de la progresión y el desarrollo de la enfermedad. Modelos animales y líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado como modelos para trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, no recapitulan completamente la enfermedad humana. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (iPSC) tienen un gran potencial para el modelado de enfermedades y proporcionan una valiosa fuente para enfoques regenerativos. En los últimos años, la generación de organoides cerebrales a partir de iPSC derivados del paciente mejoró las perspectivas de modelado de enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, faltan protocolos que producen un gran número de organoides y un alto rendimiento de neuronas maduras en sistemas de cultivo 3D. El protocolo presentado es un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable de organoides humanos derivados de iPSC en condiciones definidas químicamente utilizando biorreactores escalables de un solo uso, en los que los organoides adquieren identidad cerebelosa. Los organoides generados se caracterizan por la expresión de marcadores específicos tanto a nivel de ARNm como de proteínas. El análisis de grupos específicos de proteínas permite la detección de diferentes poblaciones de células cerebelosas, cuya localización es importante para la evaluación de la estructura organoide. La criocisión organoidea y la inmunostaining de las rodajas organoides se utilizan para evaluar la presencia de poblaciones específicas de células cerebelosas y su organización espacial.
Introduction
La aparición de células madre pluripotentes humanas (PSC) representa una excelente herramienta para la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades, ya que estas células se pueden diferenciar en la mayoría de los linajes celulares del cuerpo humano1,,2. Desde su descubrimiento, la diferenciación de PSC utilizando diversos enfoques se ha informado para modelar diferentes enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recientemente, ha habido informes de culturas 3D derivadas de PSC que se asemejan a estructuras cerebrales humanas; estos se llaman organoides cerebrales3,7,8. La generación de estas estructuras a partir de PSC saludables y específicos para el paciente proporciona una valiosa oportunidad para modelar el desarrollo humano y los trastornos del neurodesarrollo. Sin embargo, los métodos utilizados para generar estas estructuras cerebrales bien organizadas son difíciles de aplicar para su producción a gran escala. Para producir estructuras lo suficientemente grandes como para recapitular la morfogénesis tisular sin necrosis dentro de los organoides, los protocolos se basan en el compromiso neuronal inicial en condiciones estáticas, seguido de encapsulación en hidrogeles y cultivo posterior en sistemas dinámicos3. Sin embargo, estos enfoques pueden limitar la posible ampliación de la producción de organoides. A pesar de que se han hecho esfuerzos para dirigir la diferenciación de PSC a regiones específicas del sistema nervioso central, incluyendo las neuronas cortical, estriado, de cerebro medio y de la médula espinal9,,10,11,12, la generación de regiones cerebrales específicas en condiciones dinámicas sigue siendo un desafío. En particular, la generación de neuronas cerebelosas maduras en estructuras 3D aún no se ha descrito. Muguruma et al. fueron pioneros en la generación de condiciones de cultivo que recapitulan el desarrollo cerebelo temprano13 y recientemente informaron de un protocolo que permite que las células madre embrionarias humanas generen una estructura polarizada que recuerda al primer trimestre cerebelo7. Sin embargo, la maduración de las neuronas cerebelosas en los estudios notificados requiere la disociación de los organoides, la clasificación de los progenitores cerebelosos, y la cocultura con células alimentadoras en un sistema de cultivo monocapa7,14,15,16. Por lo tanto, la generación reproducible de los organoides cerebelosos deseados para el modelado de enfermedades en condiciones definidas sigue siendo un desafío asociado con el cultivo y la variabilidad de la fuente del alimentador.
Este protocolo presenta condiciones óptimas de cultivo para la expansión 3D y la diferenciación eficiente de las PSC humanas en neuronas cerebelosas utilizando biorreactores de rueda vertical de un solo uso (ver Tabla de Materiales para especificaciones), en adelante llamados biorreactores. Los biorreactores están equipados con un gran impulsor vertical, que en combinación con un fondo en forma de U, proporcionan una distribución de cizallamiento más homogénea dentro del recipiente, permitiendo una mezcla suave y uniforme y la suspensión de partículas con velocidades de agitación reducidas17. Con este sistema, se pueden obtener agregados celulares controlados por forma y tamaño, lo que es importante para una diferenciación más homogénea y eficiente. Además, un mayor número de organoides derivados de iPSC se pueden generar de una manera menos laboriosa.
La característica principal de los organoides, que son estructuras multicelulares 3D generalmente formadas a partir de células madre, es la auto-organización de diferentes tipos celulares que forma formas específicas como las observadas en la morfogénesis humana18,,19,,20. Por lo tanto, la morfología organoide es un criterio importante a evaluar durante el proceso de diferenciación. La criosectación de organoides y la inmunostaining de rodajas organoides con un conjunto específico de anticuerpos permiten la visualización espacial de marcadores moleculares para analizar la proliferación celular, la diferenciación, la identidad de la población celular y la apoptosis. Con este protocolo, mediante la inmunodetermación de criocciones organoides, un compromiso neuronal eficiente inicial se observa por el día7 de diferenciación. Durante la diferenciación, se observan varias poblaciones celulares con identidad cerebelosa. Después de 35 días en este sistema dinámico, el neuroepithelium cerebeloso se organiza a lo largo de un eje apicobasal, con una capa apical de progenitores proliferantes y neuronas postmitoticas ubicadas basalmente. Durante el proceso de maduración, de los días 35-90 de diferenciación, se pueden observar distintos tipos de neuronas cerebelosas, incluyendo células de Purkinje (Calbindin+), células de gránulos (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de cepillo unipolar (TBR2+), y neuroleins de proyección de núcleos cerebelosos profundos (TBR1+). Además, se observa una cantidad no insignificante de muerte celular en los organoides cerebelosos generados después de 90 días en el cultivo.
En este sistema, los organoides humanos derivados de iPSC maduran en diferentes neuronas cerebelosas y sobreviven hasta 3 meses sin necesidad de disociación y cocultura alimentadora, proporcionando una fuente de neuronas cerebelosas humanas para el modelado de enfermedades.
Protocol
Representative Results
Discussion
La necesidad de grandes números de células, así como condiciones de cultivo definidas para generar tipos celulares específicos para la detección de fármacos y aplicaciones de medicina regenerativa ha estado impulsando el desarrollo de sistemas de cultivo escalables. En los últimos años, varios grupos han reportado la generación escalable de progenitores neuronales y neuronas funcionales32,33,34, proporcionando avances s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta obra fue apoyada por la Fundación Para la Ciudad y la Tecnología (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 a través del Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Proyecto N. 007317, PD/BD/105773/2014 a T.P.S y PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), proyectos cofinanciados por FEDER (POR Lisboa 2020—Programación Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 32020) y FCT a través de la subvención PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 y CEREBEX Generación de Organoides Cerebelosos para Ataxia Research subvención LISBOA-01-0145-FEDER-029298. La financiación también se recibió del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, en virtud del Acuerdo de Subvención número 739572—El Centro de Descubrimientos de Medicina Regenerativa y de Precisión H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
Riferimenti
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