Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning
Summary
Detta protokoll beskriver ett dynamiskt odlingssystem för att producera kontrollerade storleksaggregat av mänskliga pluripotenta stamceller och ytterligare stimulera differentiering i cerebellar organoider under kemiskt definierade och feeder-fria förhållanden med hjälp av en engångsbioreaktor.
Abstract
Lillhjärnan spelar en avgörande roll i underhållet av balans och motorisk koordination, och en funktionell defekt i olika cerebellar nervceller kan utlösa cerebellar dysfunktion. De flesta av de nuvarande kunskaperna om sjukdomsrelaterade neuronala fenotyper är baserad på postmortem vävnader, vilket gör förståelsen av sjukdomsprogression och utveckling svårt. Djurmodeller och förevigade cellinjer har också använts som modeller för neurodegenerativa störningar. De rekapitulerar dock inte helt sjukdomar hos människor. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har stor potential för sjukdomsmodellering och utgör en värdefull källa för regenerativa metoder. Under de senaste åren, generering av cerebrala organoider från patient-härledda iPSCs förbättrat utsikterna för neurodegenerativa sjukdom modellering. Men, protokoll som producerar ett stort antal organoider och en hög avkastning av mogna nervceller i 3D-kultursystem saknas. Det protokoll som presenteras är en ny metod för reproducerbara och skalbara generationen av mänskliga iPSC-härledda organoider under kemiskt definierade förhållanden med hjälp av skalbara engångsbioreaktorer, där organoider förvärva cerebellar identitet. De genererade organoiderna kännetecknas av uttryck av specifika markörer på både mRNA och proteinnivå. Analysen av specifika grupper av proteiner möjliggör detektion av olika cerebellarcellpopulationer, vars lokalisering är viktig för utvärdering av organoidstruktur. Organoid cryosectioning och ytterligare immunostaining av organoid skivor används för att utvärdera förekomsten av specifika cerebellar cell populationer och deras rumsliga organisation.
Introduction
Uppkomsten av mänskliga pluripotenta stamceller (PSC) utgör ett utmärkt verktyg för regenerativ medicin och sjukdom modellering, eftersom dessa celler kan differentieras till de flesta cell härstamningar av människokroppen1,2. Sedan upptäckten har PSC-differentiering med olika metoder rapporterats för att modellera olika sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar3,4,5,6.
Nyligen har det förekommit rapporter om 3D-kulturer som härrör från PSCS liknar mänskliga cerebrala strukturer; dessa kallas hjärnorganoider3,7,8. Genereringen av dessa strukturer från både friska och patientspecifika PSCs ger en värdefull möjlighet att modellera mänsklig utveckling och neuroutvecklingsstörningar. Men de metoder som används för att generera dessa välorganiserade cerebrala strukturer är svåra att tillämpa för sin storskaliga produktion. För att producera strukturer som är tillräckligt stora för att rekapitulera vävnadsmorkosogenes utan nekros inuti organoiderna, protokoll förlita sig på den inledande neurala engagemang i statiska förhållanden, följt av inkapsling i hydrogeler och efterföljande kultur i dynamiska system3. Sådana tillvägagångssätt kan dock begränsa den potentiella uppskalning av organoid produktion. Även om ansträngningar har gjorts för att direkt PSC differentiering till specifika regioner i centrala nervsystemet, inklusive kortikala, striatal, mellanhjärnan, och ryggmärgen nervceller9,10,11,12, är generering av specifika hjärnregioner i dynamiska förhållanden fortfarande en utmaning. I synnerhet har generationen av mogna cerebellar nervceller i 3D-strukturer ännu inte beskrivas. Muguruma et al. banat väg för generering av kultur villkor som rekapitulera tidigt cerebellar utveckling13 och nyligen rapporterade ett protokoll som gör det möjligt för mänskliga embryonala stamceller för att generera en polariserad struktur som påminner om den första trimestern lillhjärnan7. Dock kräver mognaden av cerebellar nervceller i de rapporterade studierna dissociation av de organoider, sortering av cerebellar progenitors, och kokultur med matarceller i en monolayer kultur system7,14,15,16. Därför är reproducerbara generationen av de önskade cerebellar organoider för sjukdom modellering under definierade förhållanden fortfarande en utmaning i samband med kultur och feeder källa variabilitet.
Detta protokoll presenterar optimala odlingsförhållanden för 3D-expansion och effektiv differentiering av mänskliga PSC till cerebellar nervceller med användning av engångsbruk vertikala hjul bioreaktorer (se Tabell över material för specifikationer), nedan kallade bioreaktorer. Bioreaktorer är utrustade med en stor vertikal pumphjul, som i kombination med en U-formad botten, ger en mer homogen skjuvning fördelning inuti kärlet, vilket möjliggör mild, enhetlig blandning och partikel suspension med minskad agitation hastigheter17. Med detta system kan man få form och storleksstyrda cellaggregat, vilket är viktigt för en mer homogen och effektiv differentiering. Dessutom kan ett större antal iPSC-härledda organoider genereras på ett mindre mödosamt sätt.
Det viktigaste inslaget i de organoider, som är 3D flercelliga strukturer som vanligtvis bildas från stamceller, är självorganisering av olika celltyper som bildar specifika former som de som ses i människans morfogenes18,19,20. Därför är organoid morfologi ett viktigt kriterium som ska utvärderas under differentieringsprocessen. Kryosektioner av organoider och ytterligare immunfärgning av organoidskivor med en specifik uppsättning antikroppar möjliggör den rumsliga visualiseringen av molekylära markörer för att analysera cellproliferation, differentiering, cellpopulationsidentitet och apoptos. Med detta protokoll, genom immunostaining organoid cryosections, en initial effektiv neurala engagemang observeras av den 7dagen av differentiering. Under differentiering observeras flera cellpopulationer med cerebellär identitet. Efter 35 dagar i detta dynamiska system, organiserar cerebellar neuroepithelium längs en apicobasal axel, med ett apikalt lager av proliferering progenitors och basally ligger postmitotiska nervceller. Under mognadsprocessen, från dagar 35–90 av differentiering, kan distinkta typer av cerebellär nervceller ses, inklusive Purkinje celler (Calbindin+), granulatceller (PAX6+/MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolär pensel celler (TBR2+), och djupa cerebellar nukleiprojektion nervceller (TBR1+). Också observeras en icke obetydlig mängd celldöd i de genererade cerebellarorganoiderna efter 90 dagar i kultur.
I detta system mognar mänskliga iPSC-härledda organoider till olika cerebellar-nervceller och överlever i upp till 3 månader utan behov av dissociation och matarkokultur, vilket ger en källa till mänskliga cerebellära nervceller för sjukdomsmodellering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet av stora cellnummer samt definierade odlingsförhållanden för att generera specifika celltyper för läkemedelsscreening och regenerativa medicintillämpningar har varit drivande i utvecklingen av skalbara odlingssystem. Under de senaste åren har flera grupper rapporterat skalbar generation av neurala progenitors och funktionella nervceller32,33,34, ger betydande framsteg i utvecklingen av nya modeller för neurodegen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 genom Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 till T.P.S och PD/BD/128376/2017 till D.E.S.N.), projekt som samfinansieras av FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) och FCT genom bidrag PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 och CEREBEX Generation av Cerebellar Organoider för Ataxia Research bevilja LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Finansiering mottogs också från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020, inom ramen för bidragsavtalet nummer 739572—”The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-wideSPREAD-01–2016–2017″.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Biologia dello sviluppo. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Biologia dello sviluppo. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
