एंजाइम लक्षण वर्णन से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तक एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख
Summary
यहां प्रस्तुत एक संवेदनशील प्रतिदीप्ति परख है जो क्लिक-रसायन विज्ञान के साथ सब्सट्रेट के रूप में डायसिलग्लिसेरिल पेप्टाइड और एल्केन-फॉस्फोलिपिड्स का उपयोग करके एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधि की निगरानी करता है।
Abstract
प्रोटियोबैक्टीरिया से लिपोप्रोटीन को तीन अभिन्न झिल्ली एंजाइमों की कार्रवाई द्वारा झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स से प्राप्त फैटी एसिड द्वारा पोस्टट्रांसलेशनल रूप से संशोधित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्राईसिलेटेड प्रोटीन होते हैं। लिपोप्रोटीन संशोधन मार्ग में पहले चरण में फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल से प्रोलिपोप्रोटीन पर एक डायसिलेग्लिसरिल समूह का हस्तांतरण शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप डायसिलेग्लिसरील प्रोलिपोप्रोटीन होता है। दूसरे चरण में, प्रोलिपोप्रोटीन के सिग्नल पेप्टाइड को एक एपोलिपोप्रोटीन बनाता है, जो बदले में फॉस्फोलिपिड से प्राप्त तीसरे फैटी एसिड द्वारा संशोधित होता है। यह अंतिम चरण एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलएनटी) द्वारा उत्प्रेरित है। अधिकांश γ-प्रोटियोबैक्टीरिया में लिपोप्रोटीन संशोधन मार्ग आवश्यक है, जिससे यह नए जीवाणुरोधी एजेंटों के विकास के लिए एक संभावित लक्ष्य बन जाता है। यहां वर्णित एलएनटी के लिए एक संवेदनशील परख है जो छोटे निरोधात्मक अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के साथ संगत है। एंजाइम और सब्सट्रेट झिल्ली-एम्बेडेड अणु हैं; इसलिए, इन विट्रो परीक्षण का विकास सीधा नहीं है। इसमें डिटर्जेंट की उपस्थिति में सक्रिय एंजाइम का शुद्धिकरण, एल्केन-फॉस्फोलिपिड्स और डायसिलग्लिसेरिल पेप्टाइड सब्सट्रेट्स की उपलब्धता और मिश्रित मिसेल में प्रतिक्रिया की स्थिति शामिल है। इसके अलावा, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) सेटअप में गतिविधि परीक्षण का उपयोग करने के लिए, युग्मित एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं पर प्रतिक्रिया उत्पाद का सीधा रीडआउट पसंद किया जाता है। इस फ्लोरोमेट्रिक एंजाइम परख में, एल्केन-ट्राईसिलेटेड पेप्टाइड उत्पाद को एक क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया के माध्यम से फ्लोरोसेंट प्रदान किया जाता है और एक मल्टीवेल प्लेट प्रारूप में पता लगाया जाता है। यह विधि अन्य एसाइलट्रांसफेरेज़ पर लागू होती है जो फैटी एसिड युक्त सब्सट्रेट्स का उपयोग करते हैं, जिसमें फॉस्फोलिपिड्स और एसाइल-सीओए शामिल हैं।
Introduction
बैक्टीरियल लिपोप्रोटीन को उनके अमीनो-टर्मिनी में सहसंयोजक रूप से बंधे फैटी एसिड की विशेषता होती है जिसके माध्यम से उन्हें झिल्ली 1,2 में लंगर डाला जाता है। प्रोटीन का परिपक्व हिस्सा संरचना और कार्य में अत्यधिक विविध है, जिससे जीवाणु कोशिका लिफाफे में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में लिपोप्रोटीन की भूमिका की व्याख्या की जाती है।
लिपोप्रोटीन को साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में सम्मिलन के बाद फॉस्फोलिपिड-व्युत्पन्न फैटी एसिड द्वारा संशोधित किया जाता है। प्रोलिपोप्रोटीन में एक हस्ताक्षर आकृति, लिपोबॉक्स होता है, जिसमें एक अपरिवर्तनीय सिस्टीन अवशेष होता है जो एसाइलेटेड हो जाता है और परिपक्व प्रोटीन में पहला एमिनो एसिड होता है। इस मार्ग का पहला चरण प्रोलिपोप्रोटीन फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल द्वारा उत्प्रेरित होता है: :d आसिलेग्लिसरिल ट्रांसफेरेज़ (एलजीटी), जो डायसिलेग्लिसरिल और सिस्टीन के बीच एक थियोथर लिंक के माध्यम से प्रोलिपोप्रोटीन पर फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल से डायसिलग्लिसरिल समूह को स्थानांतरित करता है। सिग्नल पेप्टिडेस II (एलएसपी) डायसिलेग्लिसेरिल प्रोलिपोप्रोटीन से सिग्नल पेप्टाइड को छोड़ देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक एपोलिपोप्रोटीन होता है जो इसके डायसिलग्लिसरील मोइटी के माध्यम से झिल्ली में लंगर डाला जाता है। तीसरा और अंतिम चरण एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलएनटी) द्वारा उत्प्रेरित होता है, जो एपोलिपोप्रोटीन पर फॉस्फोलिपिड की एसएन -1 स्थिति से फैटी एसिड जोड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्राइसिलेटेड परिपक्व लिपोप्रोटीन (चित्रा 1)3) होता है। एलएनटी प्रतिक्रिया एक दो-चरण पिंग-पोंग प्रतिक्रिया है जहां एक स्थिर थियोएस्टर एसाइल एंजाइम मध्यवर्ती बनता है। प्रतिक्रिया के दूसरे चरण में एपोलिपोप्रोटीन सब्सट्रेट के एसाइलेशन से पहले लाइसोफॉस्फोलिपिड बायप्रोडक्ट जारी किया जाता है।
फॉस्फोलिपिड सब्सट्रेट विशिष्टता को एक उच्च प्रतिशत ट्राइस-ट्राइसिन यूरिया एसडीएस-पेज4 पर एन-एसाइल डायसिलेग्लिसरिल पेप्टाइड की गतिशीलता बदलाव के आधार पर एलएनटी परख में निर्धारित किया जाता है। छोटे ध्रुवीय हेडग्रुप, संतृप्त [एसएन -1] और नॉनसैचुरेटेड [एसएन -2] के साथ फॉस्फोलिपिड्स पसंदीदा सब्सट्रेट4 थे। जेल शिफ्ट परख एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के व्यापक गतिज अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है और न ही एचटीएस के लिए निरोधात्मक अणुओं की पहचान करने के लिए उपयुक्त है। एल्काइन फैटी एसिड का उपयोग करके क्लिक-रसायन विज्ञान का सफलतापूर्वक बैक्टीरिया5 में लिपोप्रोटीन संशोधन और यूकेरियोट्स 6 में फैटी एसिड चयापचय का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गयाहै। हाल ही में, इनहिबिटर7 की पहचान करने के लिए रास पामिटोलेशन की एक इन विट्रो परख की सूचना दी गई थी।
यहां वर्णित विधि में, डिटर्जेंट में शुद्ध सक्रिय एलएनटी को मिश्रित मिसेल में सब्सट्रेट्स के साथ इनक्यूबेट किया जाता है ताकि एल्काइन-ट्राईसिलेटेड पेप्टाइड बनाया जा सके जो बाद में फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित एलएनटी परख के लिए प्रोटोकॉल, ट्राईसिलेटेड उत्पाद की प्रतिदीप्ति पहचान के आधार पर, संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। स्ट्रेप्टाविडिन के लिए बायोटिन का विशिष्ट और कुशल बंधन प?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोटोकॉल पर उपयोगी सुझावों के लिए इंस्टीट्यूट पाश्चर पेरिस में केमोजीनोमिक एंड बायोलॉजिकल स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म, सेंटर फॉर टेक्नोलॉजिकल रिसोर्सेज एंड रिसर्च (सी 2आरटी) से फैब्रिस अगोउ और एलिक्स बूचरलैट को धन्यवाद देते हैं, समर्थन और वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए बीजीपीबी यूनिट के सभी सदस्य, और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए साइमन लेगुड। काम को इंस्टीट्यूट कार्नोट संक्रामक रोगों और इंस्टीट्यूट कार्नोट माइक्रोब्स एंड हेल्थ (15 सीएआरएन 0017-01 और 16 सीएआरएन 0023-01) की वैश्विक देखभाल पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
Riferimenti
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