Presentert her er en sensitiv fluorescensanalyse for å overvåke apolipoprotein N-acyltransferaseaktivitet ved bruk av diacylglycerylpeptid og alkyn-fosfolipider som substrater med klikkkjemi.
Lipoproteiner fra proteobakterier er posttranslasjonelt modifisert av fettsyrer avledet fra membranfosfolipider ved virkningen av tre integrerte membranenzymer, noe som resulterer i triacylerte proteiner. Det første trinnet i lipoproteinmodifiseringsveien innebærer overføring av en diacylglycerylgruppe fra fosfatidylglyserol til prolipoproteinet, noe som resulterer i diacylglyceryl prolipoprotein. I det andre trinnet spaltes signalpeptidet til prolipoprotein, og danner et apolipoprotein, som igjen modifiseres av en tredje fettsyre avledet fra et fosfolipid. Dette siste trinnet katalyseres av apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Lipoproteinmodifiseringsveien er viktig i de fleste γ-proteobakterier, noe som gjør det til et potensielt mål for utvikling av nye antibakterielle midler. Beskrevet her er en sensitiv analyse for Lnt som er kompatibel med høy gjennomstrømningsscreening av små hemmende molekyler. Enzymet og substratene er membran-innebygde molekyler; Derfor er utviklingen av en in vitro-test ikke enkel. Dette inkluderer rensing av det aktive enzymet i nærvær av vaskemiddel, tilgjengeligheten av alkyn-fosfolipider og diacylglycerylpeptidsubstrater, og reaksjonsbetingelsene i blandede miceller. Videre, for å kunne bruke aktivitetstesten i et oppsett med høy gjennomstrømningsscreening (HTS), foretrekkes direkte avlesning av reaksjonsproduktet fremfor koblede enzymatiske reaksjoner. I denne fluorometriske enzymanalysen blir det alkyntriacylerte peptidproduktet gjort fluorescerende gjennom en klikkkjemireaksjon og detektert i et multiwell plateformat. Denne metoden gjelder for andre acyltransferaser som bruker fettsyreholdige substrater, inkludert fosfolipider og acyl-CoA.
Bakterielle lipoproteiner er preget av kovalent bundne fettsyrer ved deres amino-termini gjennom hvilke de er forankret i membraner 1,2. Den modne delen av proteinet er svært variert i struktur og funksjon, og forklarer dermed lipoproteinets rolle i forskjellige biologiske prosesser i bakteriecellehylsteret.
Lipoproteiner modifiseres av fosfolipidavledede fettsyrer etter innføring i cytoplasmisk membran. Prolipoproteinene inneholder et signaturmotiv, lipoboksen, som inneholder en invariant cysteinrest som blir acylert og den første aminosyren i det modne proteinet. Det første trinnet i denne banen katalyseres av prolipoprotein fosfatidylglycerol: :d iacylglyceryltransferase (Lgt), som overfører diacylglycerylgruppen fra fosfatidylglyserol til prolipoproteinet via en tioeterforbindelse mellom diacylglyceryl og cystein. Signalpeptidase II (Lsp) spalter signalpeptidet fra diacylglyceryl prolipoprotein, noe som resulterer i et apolipoprotein som er forankret i membranen gjennom sin diacylglyceryl-del. Det tredje og siste trinnet katalyseres av apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt), som tilfører en fettsyre fra sn-1-posisjonen av fosfolipid til apolipoprotein, noe som resulterer i triacylert modent lipoprotein (figur 1)3. Lnt-reaksjonen er en to-trinns ping-pong-reaksjon hvor et stabilt tioester acylenzym-mellomprodukt dannes. Lysofosfolipidbiproduktet frigjøres før acylering av apolipoproteinsubstratet i det andre trinnet av reaksjonen.
Fosfolipidsubstratets spesifisitet bestemmes i en Llt-analyse basert på mobilitetsskiftet av N-acyl diacylglycerylpeptid på en høy prosentandel Tris-Tricine Urea SDS-SIDE4. Fosfolipider med små polare hodegrupper, mettede [sn-1] og ikke-mettede [sn-2], var foretrukne substrater4. Gelskiftanalysen er ikke egnet for omfattende kinetiske studier av apolipoprotein N-acyltransferase eller for HTS for å identifisere hemmende molekyler. Klikkkjemi ved bruk av alkynfettsyrer har blitt brukt til å studere lipoproteinmodifisering i bakterier5 og fettsyremetabolisme i eukaryoter6. Nylig ble det rapportert en in vitro-analyse av Ras palmitoylation for å identifisere inhibitorer7.
I metoden beskrevet her inkuberes renset aktiv Lnt i vaskemiddel med substrater i blandede miceller for å danne alkyntriacylert peptid som senere detekteres ved fluorescensspektrometri.
Protokollen for Lnt-analysen beskrevet her, basert på fluorescensdeteksjon av det triacylerte produktet, er følsom og reproduserbar. Den spesifikke og effektive bindingen av biotin til streptavidin er et sentralt element i analysen. Alkyne-POPE-substrat igjen etter fullføring av Lnt-reaksjonen er også fluorescerende merket med FAM, men fjernes effektivt etter binding på streptavidinplatene ved flere vasketrinn. Videre påvirker tillegg av DMSO ikke LNT-aktiviteten og har ingen innvirkning på analysen. Både substra…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Fabrice Agou og Alix Boucharlat fra Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) ved Institut Pasteur Paris for nyttige forslag til protokollen, alle medlemmer av BGPB Unit for støtte og vitenskapelige diskusjoner, og Simon Legood for kritisk lesing av manuskriptet. Arbeidet ble finansiert av Global Care Initiatives fra Institute Carnot Infectious diseases og Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 og 16 CARN 0023-01).
Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |