هنا نصف طريقة لتوليد الكتاكيت الخالية من الجراثيم من بيض خط اللاحم التجاري ، Ross PM3. يمكن تكييف هذه الطريقة لتوليد الحيوانات الخالية من الجراثيم من أنواع الدواجن الأخرى.
يتم تسهيل الدراسات المتعلقة بمساهمة ميكروبات الأمعاء في فسيولوجيا المضيف والكفاءة المناعية من خلال توافر النماذج الحيوانية الخالية من الجراثيم ، والتي تعتبر المعيار الذهبي. طيور التعشيش هي نماذج مثالية لإنتاج خالية من الجراثيم حيث لا توجد حاجة لتربية أقاربها في ظل ظروف معقمة. يتم توليد الدجاج الخالي من الجراثيم بشكل رئيسي من خطوط تجريبية محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، والتي تمثل بشكل سيئ خطوط الدجاج التجارية. سمحت الطريقة المقترحة هنا بإنتاج دجاج خال من الجراثيم من خط اللاحم سريع النمو Ross PM3 ، الذي يشيع استخدامه من قبل صناعة الدواجن. تم جمع البيض بسرعة بعد وضعه في مزرعة مربي اللاحم. خضعوا لعملية إزالة تلوث صارمة من المجموعة إلى الإدخال في عازل تفريخ البيض المعقم. تم تفريخ الكتاكيت والاحتفاظ بها في هذه العوازل المعقمة خلال الفترة اللازمة للتحكم في عقمها. تم تطوير البروتوكول الحالي في الأصل لخط الساق الأبيض SPF التجريبي ، وقد تم تكييفه ليس فقط مع خط الدجاج اللاحم Ross PM3 ولكن أيضا مع السمان. ولذلك فهو يمثل إجراء قويا وقابلا للتكيف بسهولة مع أنواع الدواجن الأخرى والطيور المعششة ذات الأهمية الاقتصادية أو البيولوجية أو الإيكولوجية.
كانت هناك زيادة كبيرة في الاهتمام العلمي والشعبي فيما يتعلق بمساهمة الميكروبات المعوية في صحة الحيوان. الميكروبات ، التي تتكون من البكتيريا والفيروسات والفطريات والعتائق التي تعيش في منافذ مختلفة في أمعاء الحيوان ، متورطة بشكل مباشر أو غير مباشر في تنظيم الأمراض الالتهابية والمعدية والأيضية التي تؤثر ليس فقط على أنواع الثدييات ولكن أيضا على الماشية ، مثل الدواجن1. تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لدراسة مساهمة ميكروبات الأمعاء في الصحة والمرض بشكل أفضل. على سبيل المثال ، تسمح الحيوانات الخالية من الجراثيم والحيوانات الجنوتوبيوتيكية بدراسة الغياب التام للميكروبات أو الميكروبات المعروفة ، على التوالي ، على علم الأمراض الفسيولوجي للعدوى 2,3. ومع ذلك ، فإن توليد هذه الحيوانات وصيانتها يتطلب تقنيات ومرافق متخصصة ، والتكاليف والعمالة والمهارات اللازمة للحفاظ عليها تحد من وصولها إلى العديد من الباحثين. في الواقع، يجب مراقبة الحيوانات الخالية من الجراثيم بانتظام بحثا عن التلوث المحتمل باستخدام مزيج من طرق زراعة البكتيريا، والفحص المجهري، والأمصال، والمورفولوجيا الإجمالية، وتقنيات الكشف القائمة على التسلسل. وتنطبق إجراءات مماثلة أيضا على الأنواع الأخرى، مثل الماشية، حيث تكون الحيوانات أكبر عموما وتتطلب مرافق أكبر لتكاثرها وصيانتها، مما قد يعوق، إلى حد ما، البحث عن الميكروبات.
الدواجن ، وبشكل أكثر تحديدا الدجاج ، هي حجر الزاوية في الإنتاج الحيواني في جميع أنحاء العالم ، مع قطيع قد يتجاوز عدد الطيور 40 مليار طائر سنويا. وهو أهم مصدر للبروتين الحيواني في العالم (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). علاوة على ذلك ، لا توجد محرمات ثقافية أو دينية مرتبطة بتربية الدجاج أو استهلاكه. تشارك ميكروبات أمعاء الدواجن بشكل مهم في نمو الحيوان ، ونسبة تحويل الأعلاف ، والمناعة ، ومقاومة مسببات الأمراض ، من بين العديد من العمليات الغذائية أو الفسيولوجية أو المرضية الأخرى4. لذلك لا غنى عن توليد الدجاج الخالي من الجراثيم للتأكيد على الحوار بين الميكروبات ومضيفها4. حتى لو كانت المجتمعات الميكروبية تعيش في قناة البيض5 للدجاج ، فإن محتوى البيضة التي تضعها الدجاجة السليمة طازجة خال في الغالب من الكائنات الحية الدقيقة ، وقشر البيض والأغشية التي تمتلك حواجز ميكانيكية لتجنب غزو الكائنات الحية الدقيقة4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تربية الكتاكيت بسهولة في غياب أقاربها ، والتي ، على عكس الثدييات ، تسمح بإنتاج خالية من الجراثيم دون تربية الوالدين في ظل ظروف معقمة.
المرفق التجريبي “علم العدوى من المزرعة والنماذج والحيوانات البرية” (PFIE، UE-1277، مركز INRAE Val de Loire، Nouzilly، فرنسا، https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) هو جزء من الشبكة الوطنية الفرنسية للبنية التحتية EMERG’IN (https://www.emergin.fr/). وقد أتقنت PFIE إنتاج الدجاج الخالي من الجراثيم لإجراء دراسات تجريبية مختلفة لأكثر من 40 عاما7،8،9،10،11. تم إنتاج هذه الحيوانات من بيض محدد خال من مسببات الأمراض (SPF) من خط وضع الساق الأبيض الذي تم تربيته في تربية مغلقة منذ عام 1970. تستخدم الطيور الخالية من الجراثيم بشكل رئيسي للدراسات الميكروبيولوجية7،8،9 ، وتعاني من عودة الاهتمام مع أسئلة مثل مساهمة ميكروبات الأمعاء في السلوك 13 ، واستخدام المغذيات14 ، وتنمية المناعة15 ونشاط الغدد الصماء. حتى لو تم نشر بعض الدراسات باستخدام خطوط اللاحم الخالية من الجراثيم16 ، فإن هذه الدراسات تظل ممثلة تمثيلا ناقصا مقارنة بالدراسات التي تستخدم خطوط الطبقة التجريبية. أدى تطور الأسئلة العلمية نحو الحديث المتبادل بين الميكروبات ومضيفها في صحة الدواجن ورفاهيتها إلى تكييف بروتوكولنا التاريخي لإنتاج دجاج التسمين الخالي من الجراثيم من خط Ross PM3 ، وهو خط الدجاج اللاحم الأكثر استخداما في العالم.
تم وصف العديد من الطرق لتوليد دجاج خال من الجراثيم سابقا7،21،22. تستخدم الطرق البسيطة ، مثل تلك المعروضة هنا ، مطهرات مختلفة لتقليل الحمل البكتيري في سطح البيض وفي العوازل. المطهرات الأكثر استخداما هي كلوريد الزئبق والأمونيوم الرباعي واليود وهيبوكلوريت الصوديوم ومحاليل ثاني أكسيد الكلور. وغالبا ما تكون النتائج مرضية. ومع ذلك ، على الرغم من إمكانية الوصول إلى هذه الطرق ، إلا أن القليل من الهياكل يمكنها تطبيق الطريقة وتربية الحيوانات على نطاق واسع ، مما يجعل استخدام الدجاج الخالي من الجراثيم نهجا نادرا نسبيا ، يستخدم فقط لمعالجة أسئلة علمية محددة للغاية. تسمح الطرق والمواد والمعدات الموصوفة هنا بنسبة تفريخ عالية الكفاءة من الفراريج الخالية من الجراثيم ، والتي تظل صحية ومعقمة لمدة 3 أسابيع على الأقل (مدة التجارب العلمية التي تم إنتاجها لها).
وأظهرت النتائج أن تكييف البروتوكول لإنتاج الكتاكيت الخالية من الجراثيم من البيض الذي تم جمعه في مزارع الدواجن التجارية ناجح. تكشف الخبرة في إنتاج بيض SPF أن كفاءة الفقس تعتمد في المقام الأول على عمر الدجاج البياض وعلى جودة البيض الذي تم جمعه. وقد أخذت كلتا المعلمتين في الاعتبار عند اختيار المزارع وجمع البيض. باستخدام نفس الطريقة ، فإن متوسط معدل تفريخ الدجاج اللاحم الخالي من الجراثيم أفضل بكثير من ذلك الذي تم الحصول عليه في آخر إنتاج للدجاج البياض SPF في منشأتنا (79٪ مقابل 35٪) ، دون التأثير على عقم الحيوانات (87٪ مقابل 83٪). قد ترتبط هذه الاختلافات بالخلفية الوراثية للطيور (الدجاج اللاحم مقابل الطبقات) وكذلك بجودة قشر البيض ، الذي من المحتمل أن يكون أكثر هشاشة في بيض SPF ، التي يتم الاحتفاظ بها في تربية مغلقة لأكثر من 40 عاما. علاوة على ذلك ، نظهر أيضا أن نقل أكثر من 2 ساعة (من المزارع إلى المنشأة التجريبية) لا يؤثر على كفاءة الفقس وجودته.
على الرغم من تحسين عملية التعقيم المستخدمة في عوازل الفقس وبروتوكول إزالة تلوث البيض ، إلا أن حوالي 10٪ من العوازل لم تكن خالية من الجراثيم. من أجل فهم أصل التلوث ، من المهم جدا إجراء مراقبة العقم الروتينية للعوازل المفقوسة قبل إدخال البيض.
فيما يتعلق بحالة عقم الطيور ، حاولنا تطبيق طرق تسمح بنمو البكتيريا اللاهوائية الهوائية وغير السريعة من عينات البراز ، وبالتالي ضمان أننا نكتشف البكتيريا الحية القابلة للحياة. تتوافق هذه الطرق مع دستور الأدوية الدولي لاختبار العقم وتمثل تقنيات سريعة وسهلة ومخفضة التكلفة لاستخدامها بشكل روتيني. ومع ذلك ، يمكن تطبيق تقنيات البيولوجيا الجزيئية مثل تسلسل الجينات 16S rRNA ، على الرغم من عدم إعطاء معلومات عن صلاحية البكتيريا ، لتأكيد وجود بكتيريا غير قابلة للزراعة. في الواقع ، اقترحت دراسة حديثة أن بعض بكتيريا ميكروبات قناة البيض للأمهات يبدو أنها تنتقل إلى الجنين من خلال بياض البيض ، مما يشكل لاحقا معظم السكان البكتيريين في الأمعاء الجنينية5. علاوة على ذلك ، اقترحت دراسة أخرى أن جزءا من المستعمرين الميكروبيين الذين تم إيواؤهم في الأجنة المبكرة كانوا موروثين من دجاج الأمهات ، وأن وفرة ميكروبات الأمعاء وتنوعها تأثرا لاحقا بالعوامل البيئية وعلم الوراثة المضيف أثناء التطور23. ومع ذلك ، تستند نتائج هذه الدراسات إلى تحليل تسلسل الحمض النووي ، حيث يمكن أن يكون عدد كبير من هذه البكتيريا ميتا أو غير قابل للتكرار في بياض البيض (محمل بشكل كبير بجزيئات مضادة للميكروبات). أجرى توماس والمتعاونونمعه 16 اختبار العقم من خلال تقييم البكتيريا الهوائية والهوائية الاختيارية القابلة للزراعة من خلال إسقاط البراز على ألواح BHI ، وبالتالي تسليط الضوء على كفاءة الطرق البكتريولوجية القياسية للتحكم في العقم الخالي من الجراثيم. علاوة على ذلك ، في البروتوكول المقترح ، استخدمنا مراقبة النمو في مرق الثيوجليكولات مع ريسازورين لتكون قادرة على اكتشاف نمو البكتيريا اللاهوائية غير القوية.
يستخدم البروتوكول بالفعل لإنتاج السمان والدجاج الخالي من الجراثيم ، وهو قابل للتكيف مع إنتاج الحيوانات الخالية من الجراثيم من معظم الطيور المعششة ويقدم وجهات نظر لدراسة مساهمة الميكروبات في فسيولوجيا هذه الحيوانات. إلى جانب استخدام هذا النموذج للتحقيق في التفاعلات المتبادلة بين المضيف والميكروبات في أمعاء الدواجن ، يمكن أن يكون مفيدا أيضا للبحوث التطبيقية. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لتقييم سلامة وفعالية البروبيوتيك المشتقة من الكائنات الحية الدقيقة المشتركة في أمعاء الدجاج لتحسين صحة الحيوان ومتانته.
The authors have nothing to disclose.
المؤلفون ممتنون للمربين وجمعية Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine ، فرنسا) لتوريد البيض المخصب. أجريت هذه الدراسة تحت رعاية اتحاد الأبحاث APR-IA “INTEGRITY” (2017-2019) ، والذي تم تمويله من قبل مركز Région Centre Val de Loire ، فرنسا.
2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
50 mL tubes | Falcon | ||
BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
Pipette aid | Drummond | ||
Plastic pipettes | |||
Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |